核酸分析技術(shù)

日期：2010-08-06 13:59:25

一、核酸電泳

（一）DNA的凝膠電泳
凝膠電泳是分子克隆的中心技術(shù)之一。

1、瓊脂糖凝膠用于分離大于200～1000bp的片段;
操作簡單、快速，且分離范圍廣，分辨率高

2、聚丙烯酰胺凝膠用于分離5－500bp的片段;
效果好、分辨率極高，相差1bp的DNA片斷就能分開，能容納相對大量的DNA
用于核苷酸多態(tài)性的分析

瓊脂糖凝膠電泳的基本過程
材料：電泳緩沖液（常用TAE或TBE）、電泳級瓊脂糖、溴化乙錠溶液（核酸顯示劑）、加樣緩沖液（保證核酸不在加樣孔中擴散和用于電泳時間的指示系統(tǒng)）、水平凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)。
基本過程：制膠→放入電泳槽中并加入電泳緩沖液→取出梳子→將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中→一定電壓條件下電泳→合適的時間后停止電泳→取出凝膠進行溴化乙錠染色→凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結(jié)果。
注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時要帶手套。不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍

影響DNA在凝膠中遷移速率的因素
1 DNA分子的大小
2 構(gòu)象
3 凝膠濃度
4 電壓
5 緩沖液

特殊的凝膠電泳
倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（FIGE）：用于分離分子量10～2000kb的DNA分子；
鉗位均勻電場電泳（CHEF電泳）：可分離大于107bp的DNA分子

（二）RNA 電泳

基本過程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點的是，因為RNA分子對RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解；另外，因為RNA分子有二、三級結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果，因此電泳時應(yīng)在變性劑存在下進行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。

二核酸雜交技術(shù)

（一）Southern Blot

原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。

用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點突變、擴增重排等。

Southern Blot 操作步驟：

DNA →瓊脂糖電泳→印跡轉(zhuǎn)移→預(yù)雜交→雜交（變性探針）→洗膜→放射自顯影或顯色

（二）Northern Blot

原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進行轉(zhuǎn)膜和用探針進行雜交檢測。

用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。

操作過程

mRNA提取→甲醛變性電泳→印跡轉(zhuǎn)移→預(yù)雜交

雜交（變性探針）→洗膜→放射自顯影或化學(xué)發(fā)光

（三）探針標記技術(shù)

1、標記物：放射性和非放射性兩種

放射性：

非放射性：生物素、地高辛素、熒光素

2、標記方法

（1）切口平移法

（2）隨機引物法

（3）末端標記法

（4）單鏈DNA探針標記

（5）寡核苷酸探針標記法

三 PCR技術(shù)

（一）PCR (Polymerase chain reaction) 是用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性－退火－DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴增。由于這種擴增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)25－30個循環(huán)后，擴增倍數(shù)可達106。
Dr. Karry Mullis 1985年發(fā)明，獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎；

（二）基本要素

1、Taq DNA聚合酶：

水生棲熱菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶
①5’→3’DNA聚合酶活性；
②無3’→5’外切酶活性，

35輪0.25%錯配，與原始模板有差別；

最適聚合酶溫度72℃，選擇72℃延伸
半衰期：92.5℃ 130min
95℃ 40min
97.5℃ 5―6min
變性溫度：≤95℃使其在整個擴增循環(huán)中保持足夠活性

pfu DNA 聚合酶耐熱
5’→3’DNA聚合酶活性
3’→5’外切酶活性
精確度：pfu %26gt;Taq
但pfu擴增效率通常比Taq酶略差

文獻報道：Taq+pfu 會起到較好效果

2、引物

人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，
Tm值要相近，每條10-50pmol /100%26#61549;l
◆設(shè)計原則：

（1）靠近5上游Primer與雙鏈DNA正鏈相同
3下游Primer與雙鏈DNA正鏈互補，與負鏈相同
正鏈5――――― 3 ――上游Primer
――下游Primer 負鏈 3――――― 5
例如：
IL-3正鏈
5GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3
負鏈3CGCTAGAAAACTCAGGTT 5
上游~：與其相同
下游~：先寫出相應(yīng)負鏈3→5然后倒過來5→3
所以負鏈Primer：5-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3

（2）Primer 本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補序列
形成loop環(huán)，內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)
如： GGGTCGATTCCTACCCATGC

（3）注意減少Primer間互補序列
導(dǎo)致2個Primer形成dimer
一般不要超過3個互補bp
如：CCCATGC ATGGAGTC
: : : : : : : :
GGGTCTA TCAGTAAGC

（4）Primer 5’未端可修飾、突變:
修飾
如：32P、生物素、熒光素，不影響其效果
突變：AGCTCCATGACCCAG
5CGCTCCATGACCCAG 3‘
注意：絕不可以在3端進行上述改造
∵DNA聚合酶是5→3聚合，若3端改造→不能互補→不能延伸

（5）primer 5’端增加堿基
①內(nèi)切酶識別點：
（G）GAATTC GCTCCATGACCCAG
↑保護bp
對PCR產(chǎn)物cloning有很大好處
便于內(nèi)切酶消化，不同內(nèi)切酶需保護bP數(shù)量不同
EcoRI 1 BglII 2-3
XbaI 2-3 HindⅢ %26gt;3
BamHI 2-3 PstI %26gt;4
XhoI %26gt;4 NotI %26gt;10
如果所用保護bp數(shù)量不合適→影響內(nèi)切酶消化→影響下步克隆
∵未切開，連接不上
②ATG起始密碼
③TAA、TAG、TGA終止密碼
如：
可溶性受體的表達，無膜內(nèi)區(qū)、穿膜區(qū)，只有膜外區(qū)。

3、模板：

可選：DNA
mRNA→逆轉(zhuǎn)錄→cDNA
DNA包括：質(zhì)粒噬菌體染色體DNA
較小較大 ①目的gene是單拷貝
變性較易變性較難 ②非常大，變性難
模板用量
Plasmid:lng
Chromosome:300-500ng
注意：
防止交叉污染

4、dNTP：

四種脫氧核苷酸，基本原料
終濃度：50%26#61549;M
注意：不穩(wěn)定，保存時間長會失效

5、Mg2+

TaqDNA聚合酶作用時需要Mg2+
不同的酶需不同Mg2+
Taq：較少，Mg2+ 對反應(yīng)影響很大，0.5-1.5mM終濃度
pfu：Mg2+ 2-3mM，dNTP、primer用量約增加一倍
外界影響：
EDTA鰲合Mg2+ ∴選較低濃度TE(10mM Tris,1mMEDTA)；
DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基團均可與Mg2+ 結(jié)合，降低Mg2+有效濃度。 ∴如果擴增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的Mg2+濃度

6、溫度和時間：

（1）變性溫度：94-95℃
Templete：GC比例高、長度很長，則變性T↑

（2）退火：溫度越高，擴增特異性越好
取決于Tm值：Tm↑退火T↑；
Tm↓退火T↓
若Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度

（3）延伸：
%26#61603;500nt---1min %26#61502;500nt－－3min
一般：40－60sec

（三）PCR技術(shù)的應(yīng)用

1、基因檢測：

2、基因克隆化

3、DNA突變

4、DNA序列分析

四、基因芯片

（一）利用核酸雜交的原理，應(yīng)用于DNA、RNA的研究
基因芯片（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）就是利用點樣機等機械裝置，在玻璃等支持物表面整齊地點上高密度的、成千上萬個“點”，每個“點”含有可與一種基因雜交的一條ＤＮＡ探針。由于芯片上有序地排列著ＤＮＡ探針，因此也被稱為微陣列（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。在芯片上滴加樣品后，在合適的條件下，樣品中含有的各種核酸片段（ｃＤＮＡ或ｃＲＮＡ）就與相應(yīng)的探針雜交。由于核酸片段上已標記有熒光素，激發(fā)后產(chǎn)生的熒光強度就與樣品中所含有的相應(yīng)核酸片段的量成正比，也就代表該基因的表達量。經(jīng)激光共聚焦掃描儀等裝置掃描后，所獲得的信息經(jīng)專用軟件分析處理，即可獲得成千上萬種基因的表達情況。正因為這種特點，基因芯片技術(shù)已成為當前生命科學(xué)研究的熱點之一。

操作流程

（1）探針的設(shè)計、合成與芯片的制作（商品化產(chǎn)品）；

（2）靶基因樣品的制備；
靶基因的制備：RT-PCR （設(shè)實驗組和對照組）
標記方法：分別進行熒光素標記如：Cy3和Cy5

（3）生化雜交反應(yīng)；與常規(guī)的分子雜交過程基本相似
封閉預(yù)雜交雜交洗脫

（4）雜交信號的檢測與結(jié)果的分析
激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)收集熒光信號，計算機分析

（二）基因芯片的應(yīng)用

用于基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測、基因組分析和后基因組研究

舉例：美國斯坦福大學(xué)Davis等用PCR法從外周血淋巴細胞cDNA文庫中得到了1046種cDNA片段，制成芯片，然后與熱處理的T淋巴細胞和未處理的T細胞種提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄出的單鏈cDNA片段雜交，經(jīng)激光共聚焦掃描系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)17個差異表達的基因，其中11個是被熱誘導(dǎo)的，6個是被熱抑制的。經(jīng)序列分析證實，其中3個是未報導(dǎo)的新基因。