Native-PAGE常見問題分析
日期：2010-08-03 14:35:00
1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時預電泳是怎么回事的？預電泳時要加6×DNA上樣緩沖液嗎？電泳1－2小時再加結合反應產物嗎？
預電泳是除去凝膠中沒有聚合的單體和雙體和聚合引發劑，提高分辨率，不加任何物質，一般３０－６０分鐘后加樣電泳。
2. 銀染的步驟是什么？銀染的關鍵因素是什么？
步驟是：
（1） 固定：10%冰乙酸30min。
（2） 清洗：雙蒸水沖洗凝膠2次，每次1min。
（3） 染色：染色液（1g硝酸銀，1.5ml 37%甲醛，1l 雙蒸水。現配）染色30min。
（4） 清洗：迅速洗凝膠1次。
（5） 顯影：30g碳酸鈉，1.5ml 37%甲醛，200μl 10mg/l 硫代硫酸鈉。顯影至清晰帶紋出現。
成功銀染的關鍵因素包括：
（1） 用超純水（比如，NANOpure或Milli-Q純化）或者是雙蒸水作銀染。
（2） 用提供的碳酸鈉或者ACS試劑級的碳酸鈉。
（3） 在染色后，水清洗所用時間的長短很重要，用不超過5-10秒的時間清洗膠，然后放入顯色溶液中，一般在水里浸一下就好。
（4） 甲醛和硫代硫酸鈉（400μl/1ml）在使用前，及時加入到顯色液中。
（5） 在使用前及時配染色液。
3. 變性PAGE的上樣緩沖液配方？如何準備上樣的蛋白？是將細胞用超聲破碎,還是用細胞裂解液,大多細胞裂解液中均含有SDS,不知有沒有用于非變性PAGE的裂解液.具有操作步驟是什么?
非變性的PAGE buffer就是0.5xTBE,上樣緩沖液可以用普通的loading buffer，含有Tris,溴芬蘭以及甘油即可，甘油是主要的沉淀作用成分。都可以自己配。細胞超聲即可，超聲后離心取上清.也有配NATIVE-PAGE gel所用buffer為1*TBE,用的running buffer也是1*TBE。還有一點就是要在配gel時考慮能使蛋白多聚體穩定的因素。
4. 做了naive---PAGE沒有條帶，蛋白質是純品，分子量很大，怎么回事呢？
因為分子量很大，8%的膠濃度較合適。加樣時加個marker，可以檢測膠制備是否有問題。銀染方法比較靈敏，如果蛋白是一種酶，且可使某種底物顯色的話，可以用活性染色試試，更靈敏。
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