挑出CpG甲基化位點的新策略
日期：2014-06-18 09:11:27
DNA甲基化是基因表達的一種有效的調節器。DNA甲基化主要發生在富含CG的區域，所以稱為CpG島。如CpG島位于某基因的啟動子區域，CpG島的甲基化會顯著降低甚至完全沉默該基因的轉錄，繼而影響蛋白的表達。但是，如何決定一個目標位點的甲基化是否會影響轉錄，是具有挑戰性的。最近，約翰霍普金斯大學的研究人員研制出一種新方法，可以闡明這個問題。
CpG二核苷酸上的DNA甲基化，是真核生物中被充分研究過的一種表觀遺傳轉錄調控機制。通常，這種形式的甲基化涉及到多個位點，但是單個CpG位點的甲基化也會影響基因的表達。為了促進單一位點甲基化研究的發展，約翰霍普金斯大學的Marc Ostermeier和他以前的研究生Brian Chaikind，開發出一種新技術，可以選擇優化的位點特異性DNA甲基轉移酶，相關研究結果發表在最近的《PLoS One》。
Ostermeier的這種最新方法以其研究小組以前描述過的一種方法為基礎，利用一種裂開的CpG甲基轉移酶——M.SssI，與可識別目標CpG位點側翼序列的鋅指結構域（ZFD）熔合在一起。
Ostermeier解釋說：“我們的想法是，分裂甲基轉移酶，這樣它就再也不能很有效地組裝，然后你用DNA作為模板，在你想要甲基化的位點上，幫助組裝甲基轉移酶。因此，你增加了這兩半甲基轉移酶的局部濃度，可以化解它們沒有組裝好這一問題。然后，它們可以組裝和甲基化那個位點。”
雖然Ostermeier的方法增加了期望CpG位點的甲基化，但仍然有明顯脫離目標的CpG甲基化。因此，在最新的進展中，他和Chaikind轉向努力降低非特異性DNA甲基化，同時保持目標位點甲基化。
新方法利用一個誘變的質粒文庫，這些質粒包含N末端M.SssI片段/ZFD熔合的編碼基因和C末端M.SssI片段/ZFD熔合的編碼基因。C末端M.SssI片段，在5個選定的殘基上攜帶隨機變異，研究人員推測，這會減少其DNA的親合力，而不影響催化活性。
利用位于甲基化敏感的FspI限制位點（兩側是鋅指結合序列）的質粒中的目標CpG位點，研究人員選擇來自FspI消化的甲基化依賴保護。然后，他們增加了創新的一步，利用與眾不同的限制酶McrBC，針對非特異性的甲基化。McrBC可消化包含兩個不同甲基化位點（而不僅僅是一個單一甲基化位點）的DNA，導致在目標CpG位點以外的一個或多個CpG位點甲基化的任何質粒DNA被消化。
FspI和McrBC消化后，核酸外切酶III消化會破壞任何裂開的質粒，留下編碼高度特異性M.SssI片段/鋅指熔合蛋白的完整質粒，用于另一輪的轉換和選擇。
從他們篩選中識別出的47個變體中，作者得到了一種優化的DNA甲基轉移酶，能顯著降低非特異性甲基化60倍，目標特異性甲基化降低很少，僅從94%降到了79%。
Chaikind和Ostermeier通過交換鋅指結構域，繼續顯示他們系統的多功能性，這些結構域結合有人類細胞間黏附分子1（ICAM1）基因啟動子區中的一個特異CpG位點的側翼序列，表明該位點被甲基化，但是非目標位點卻沒有。
目前，該研究小組計劃在真核細胞中靶定那個單一的ICAM1 CpG位點，以檢測其位點特異性甲基化是否像其他研究顯示的那樣，會影響ICAM1的表達，也將驗證這種位點特異性CpG甲基轉移酶在真核生物研究中的效用。
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