生工精選：基于PCR方法的基因序列全長獲取策略

日期：2012-12-21 09:52:45

在最新一期《中國生物工程雜志》上，來自吉林農業大學動物科技學院的研究人員發表了題為“基于PCR方法的基因序列全長獲取策略”的文章，介紹了基于PCR方法的基因序列全長獲取方法，這將有助于基因結構、功能及其表達產物特性的研究。

高通量DNA測序技術的建立與發展為基因組數據庫的建立與研究奠定了基礎，但是作為一種補充，通過酵母雙雜交、抑制性消減雜交、基因芯片技術、噬菌體表面展示等分子生物學和生物信息學技術進行特定性狀目標基因的鑒定和分析，同樣具有重要意義。利用這些技術篩選得到的部分基因序列獲得目標基因的全長序列，為目標基因生物學功能的進一步研究和應用奠定了前期基礎。

對于基因組測序已經完成的少數物種來說，可以輕松地從數據庫中找到已知序列的側翼序列，但是這只是研究少數模式生物的情況。而對于自然界中種類繁多的其他生物而言，基于PCR技術建立的多種染色體步移方法和cDNA末端快速擴增技術實現了通過已知片段快速獲取未知基因序列的研究目標。依據原理，該方法可分為反向PCR 、外源接頭介導PCR和隨機引物PCR三類。各類技術各有優缺點，且應用的主要領域和潛力各有差別。

文章介紹了反向PCR，外源接頭介導PCR，隨機引物PCR的各方面情況，指出，雖然早期建立的反向PCR連接效率較低，易產生較高的非特異性擴增，但簡單快捷的特點使其在鑒定T-DNA插入位點、基因融合位點等方面應用較多，外源接頭介導PCR則因特異性的提高而備受歡迎，并衍生出單特異引物PCR、捕獲PCR和步降PCR等多種技術，取得了較理想的擴增效果。

而在大量樣品分析中，自動化程度較高的隨機引物PCR則更具優勢。隨著功能強大的聚合酶、連接酶、反轉錄酶的發現，推動了各種基于PCR的基因序列全長獲取策略的發展，很多策略也因此而得以改進和整合，并獲取更理想的實驗結果，為研究基因結構、功能及其表達產物特性的研究提供了更完整的信息。

文章最后也指出了這些PCR方法的一些局限性，比如I-PCR必須借助于特異引物和環化處理，具有一定的特異性，外源接頭介導PCR雖擁有較高的特異性和類似I-PCR的實用性，但步驟較為繁瑣。兩種方法都要進行酶切消化，對限制性內切核酸酶產品有一定的選擇要求，對樣品數量及質量也有較高要求。

而TAIL-PCR雖然采用了不適合于高度重復序列分析的隨機引物，但與多對特異引物組合，通過巢式擴增和溫度篩選提高了反應特異性，同時，其自動化程度較高，在對大量樣品及轉座子等大量插入位點側翼序列分析時，該方法顯示了非常優越的特點。

RACE技術在cDNA全長序列獲取上具有快速有效特點，但由于poly(T)或poly(G)引物的應用，特異性受到影響。

隨著不同方法的相互結合與滲透，優勢互補，將會促使完整基因組序列的快速高效獲取，并逐步提高其特異性。TAIL-PCR有效減少了非特異性擴增，PEETA法不但有效地克服了“CpG島” 的不良影響，也提高了特異性。如果兩者結合使用，相信可以獲得更理想的結果。而將染色體步移的特異性和高效性與RACE的簡單快速結合起來將會建立起新的更高效的RACE技術，更好地服務于科研。