攻克多重PCR之難（上篇）

日期：2012-11-06 07:37:01

多重PCR能夠在提高通量的同時(shí)節(jié)省樣品降低成本，它需要耗費(fèi)更多的時(shí)間和精力，同時(shí)也會(huì)給用戶回報(bào)更豐富的數(shù)據(jù)。本文介紹了一些實(shí)驗(yàn)技巧和商業(yè)化工具，希望能幫您輕松獲得好結(jié)果。

PCR的重要性毋庸贅述，這一諾貝爾獲獎(jiǎng)技術(shù)的普及帶動(dòng)了現(xiàn)代基因組學(xué)、鑒定技術(shù)、醫(yī)療診斷等領(lǐng)域的發(fā)展。如今，PCR幾乎是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室必備的通用技術(shù)，不過要跑好一個(gè)PCR也并非那么簡單，由于PCR反應(yīng)很靈敏，PCR的效果很容易受到污染和脫靶效應(yīng)的影響。我們在設(shè)計(jì)PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)須得將引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)條件和酶的選擇一一考慮周全。這一點(diǎn)在多重PCR中尤為明顯，因?yàn)槎嘀?/SPAN>PCR需要在一個(gè)管中同時(shí)檢測多個(gè)目標(biāo)（通常二至五個(gè)）。多重PCR應(yīng)用也很廣泛，可以用來做基因表達(dá)分析、SNP分型、STR分型等鑒定以及病原菌檢測等等。

多重PCR的反應(yīng)數(shù)相對較少，所消耗的試劑也較少，是一個(gè)頗為經(jīng)濟(jì)的選擇。人們往往選用多重PCR來處理臨床樣本等珍貴樣本，或者用來增加實(shí)驗(yàn)通量，每個(gè)樣本所需的孔少了，那么一個(gè)微孔板自然就能容納更多的樣本。

反應(yīng)體系包括模板DNA、兩個(gè)擴(kuò)增引物、酶和緩沖液，一般最后通過凝膠電泳來檢測所得的擴(kuò)增產(chǎn)物。定量PCR除上述元素之外，還需要熒光探針以便檢測反應(yīng)的進(jìn)行，不過就不需要進(jìn)行凝膠電泳了。

從一般PCR到多重PCR，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的難度也隨之翻倍。如果說擴(kuò)增一個(gè)片段需要三條引物，那么兩個(gè)片段就需要六條，三個(gè)片段需要九條，以此類推。這些引物既不能互相結(jié)合，也不能與模板DNA上目標(biāo)片段以外的區(qū)域結(jié)合。此外，我們還要考慮同時(shí)檢測不同的擴(kuò)增子，要么就使不同擴(kuò)增子大小不一以便凝膠電泳，要么就讓它們帶上不同熒光染料以便區(qū)分。更麻煩的是，多重PCR中的不同擴(kuò)增片段還會(huì)互相競爭資源，其結(jié)果是高豐度模板能夠被很容易的檢測到，而低豐度的模板徹底淪為背景。

上述困難都是進(jìn)行多重PCR的絆腳石，“大多數(shù)人都嫌太麻煩了，”Life Tech的資深科學(xué)家Jonathan Wang說“有許多客戶對多重PCR感興趣，但遇到這些麻煩之后，他們都選擇了放棄，”安捷倫公司的產(chǎn)品經(jīng)理Laura Mason補(bǔ)充道。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)小tips其實(shí)假如咱們迎難而上，還是有許多工具和小竅門可以幫得上忙的。NEB的資深科學(xué)家Nicole Nichols為正在設(shè)計(jì)多重PCR反應(yīng)的研究者們推薦了以下五條基本原則。

原則一A：引物設(shè)計(jì)

“引物設(shè)計(jì)這一步是沒法跳過的，” Nichols說。“從一開始就好好注意細(xì)節(jié)，最終將能為你節(jié)省很多優(yōu)化時(shí)間。”

她推薦引物設(shè)計(jì)得比一般稍長一點(diǎn)（24–35 bases），解鏈溫度稍高一點(diǎn)（65 °C以上），并且GC含量控制在50–60%。當(dāng)然除此以外，PCR引物設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則是肯定要遵守的：保持幾對引物解鏈溫度相似、避免互補(bǔ)序列、避免3’端出現(xiàn)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，以及以及驗(yàn)證、驗(yàn)證、再驗(yàn)證。

多重定量PCR不能用SYBR Green等插入染料，探針法是唯一的選擇，例如Life Tech公司的TaqMan®探針或者IDT公司的PrimeTime® 探針。Bio-Rad公司的經(jīng)理Keith Cockrum建議將這些探針的解鏈溫度設(shè)計(jì)得比擴(kuò)增引物的高7–8 °C。“我們要讓探針先退火，”他解釋說，要不然序列就會(huì)在沒有探針的情況下進(jìn)行擴(kuò)增，他將這種無法檢測到的擴(kuò)增反應(yīng)稱為“endogenous PCR”。“這是我們想要的特異性PCR反應(yīng)，我們只是無法檢測到其發(fā)光，”他解釋道。

原則一B：引物驗(yàn)證

引物驗(yàn)證必不可少的步驟，Cockrum建議，首先將每對引物分別在模板上進(jìn)行測試，這里的模板指對照樣本，例如安捷倫公司的QPCR Reference Total RNA。可用SYBR Green熔解曲線分析引物對是否擴(kuò)增出單一產(chǎn)物。另外還要引入溫度梯度，以確定所有引物都能起作用的溫度范圍。如果有一對引物不能與其他引物一同起作用，她建議直接放棄這對引物重新開始設(shè)計(jì)，“放棄并重新設(shè)計(jì)其實(shí)比不斷優(yōu)化要好的多。”

如果要做多重定量PCR，Cockrum建議先在單重反應(yīng)中測試探針，用一系列稀釋度來確定每個(gè)探針的動(dòng)態(tài)區(qū)域。最后再把所有元素組合到一起，確保各自的特異性、敏感性、動(dòng)態(tài)區(qū)域等沒有受到影響。“如果將以上都進(jìn)行了論證，你就會(huì)擁有一個(gè)非常棒的多重PCR實(shí)驗(yàn)，”Cockrum說。

原則二：引物濃度

Nichols推薦的第二項(xiàng)原則是，保證每個(gè)引物濃度都低于單重PCR中的濃度，否則“反應(yīng)中的總引物濃度會(huì)就會(huì)太高”。傳統(tǒng)PCR反應(yīng)中引物濃度為0.2 μM，那么我們可以試試0.15 μM（引物濃度范圍通常在0.05 μM至0.4 μM之間）。