PLoS：構建植物ihpRNA新方法

日期：2012-06-13 08:08:34

來自中科院華南植物園，中國熱帶農業科學院等處的研究人員發表了題為“High-Throughput Construction of Intron-Containing Hairpin RNA Vectors for RNAi in Plants”的文章，設計出了一種基于Golden Gate克隆技術構建含內含子發夾結構RNA（ihpRNA）表達載體的新方法。相關成果公布在國際學術期刊PLoS ONE上。

文章的通訊作者是華南植物園華南農業植物遺傳育種重點實驗室段俊研究員，以及中國熱帶農業科學院趙鵬（Peng Zhao，音譯），第一作者是博士生言普。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是通過雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介導，特異性地降解靶mRNA，使同源的靶基因發生沉默，即序列特異性轉錄后基因沉默(Post-Transcriptional Gene Silencing，PTGS)，從而誘使細胞表現出特定基因缺失的表型。RNAi現象普遍存在于從真菌到植物、從無脊椎動物到哺乳動物的各種生物中。如真菌的靜息作用、植物的轉錄后基因沉默、動物的RNAi，雖然在不同物種中的名稱不同，但其分子機制極其相似。

自從發現雙鏈RNA能引發RNA干擾現象后，RNAi已經成為分析基因功能的重要工具之一。隨著RNAi技術在植物基因功能分析上的廣泛應用，迫切需要一種高通量構建發夾RNA（hpRNA）表達載體的方法。

在這篇文章中，研究人員設計出了一種基于Golden Gate克隆技術構建含內含子發夾結構RNA（ihpRNA）表達載體的新方法。利用該方法，只需在擴增靶基因序列的同時，由引物在序列兩端加上相應的BsaI識別和切割位點，經一步酶切/連接反應后，此靶基因片段能同時以正向和反向的位置克隆到pRNAi-GG，形成ihpRNA表達載體結構。

而且整個構建過程只需在一管中通過一個反應完成，構建效率高，且無背景干擾，同時由于pRNAi-GG為植物雙元表達載體，構建好的ihpRNA表達載體可直接用于農桿菌轉化研究。這一載體構建方法具有簡單、快速、高效和成本低等優點，為大規模的植物功能基因研究提供了一個高通量的平臺。

之前的研究曾表明，用含有內含子的發夾RNAi結構表達dsRNA的植物中，90%表現出沉默效應，而用發夾RNA(Hairpin RNA，hpRNA)、正義和反義結構分別僅有58%、13%和12%的沉默效應。因此針對ihpRNA的研究，逐漸受到了科學家們的關注。

曾有研究人員利用Gateway重組克隆技術，構建高通量基因沉默的載體系列pHELLSGATE，包括全部擬南芥基因組的ihpRNA轉基因系。還有科學家也根據Gateway技術開發了一種專門針對水稻基因組功能分析的RNA干擾載體-pANDA。還有用于高通量植物功能基因組構建的載體系列，包括適合組成型表達、誘導型異常表達的GUS或GFP融合蛋白雙元載體，和以煙草花葉病毒為基礎構建的高通量VICS載體系列。