PLoS：構(gòu)建植物ihpRNA新方法

日期：2012-06-12 10:45:56

來自中科院華南植物園，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院等處的研究人員發(fā)表了題為“High-Throughput Construction of Intron-Containing Hairpin RNA Vectors for RNAi in Plants”的文章，設(shè)計(jì)出了一種基于Golden Gate克隆技術(shù)構(gòu)建含內(nèi)含子發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（ihpRNA）表達(dá)載體的新方法。相關(guān)成果公布在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊PLoS ONE上。

文章的通訊作者是華南植物園華南農(nóng)業(yè)植物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室段俊研究員，以及中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院趙鵬（Peng Zhao，音譯），第一作者是博士生言普。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是通過雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)，特異性地降解靶mRNA，使同源的靶基因發(fā)生沉默，即序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-Transcriptional Gene Silencing，PTGS)，從而誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型。RNAi現(xiàn)象普遍存在于從真菌到植物、從無脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物的各種生物中。如真菌的靜息作用、植物的轉(zhuǎn)錄后基因沉默、動(dòng)物的RNAi，雖然在不同物種中的名稱不同，但其分子機(jī)制極其相似。

自從發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA能引發(fā)RNA干擾現(xiàn)象后，RNAi已經(jīng)成為分析基因功能的重要工具之一。隨著RNAi技術(shù)在植物基因功能分析上的廣泛應(yīng)用，迫切需要一種高通量構(gòu)建發(fā)夾RNA（hpRNA）表達(dá)載體的方法。

在這篇文章中，研究人員設(shè)計(jì)出了一種基于Golden Gate克隆技術(shù)構(gòu)建含內(nèi)含子發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（ihpRNA）表達(dá)載體的新方法。利用該方法，只需在擴(kuò)增靶基因序列的同時(shí)，由引物在序列兩端加上相應(yīng)的BsaI識(shí)別和切割位點(diǎn)，經(jīng)一步酶切/連接反應(yīng)后，此靶基因片段能同時(shí)以正向和反向的位置克隆到pRNAi-GG，形成ihpRNA表達(dá)載體結(jié)構(gòu)。

而且整個(gè)構(gòu)建過程只需在一管中通過一個(gè)反應(yīng)完成，構(gòu)建效率高，且無背景干擾，同時(shí)由于pRNAi-GG為植物雙元表達(dá)載體，構(gòu)建好的ihpRNA表達(dá)載體可直接用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化研究。這一載體構(gòu)建方法具有簡(jiǎn)單、快速、高效和成本低等優(yōu)點(diǎn)，為大規(guī)模的植物功能基因研究提供了一個(gè)高通量的平臺(tái)。

之前的研究曾表明，用含有內(nèi)含子的發(fā)夾RNAi結(jié)構(gòu)表達(dá)dsRNA的植物中，90%表現(xiàn)出沉默效應(yīng)，而用發(fā)夾RNA(Hairpin RNA，hpRNA)、正義和反義結(jié)構(gòu)分別僅有58%、13%和12%的沉默效應(yīng)。因此針對(duì)ihpRNA的研究，逐漸受到了科學(xué)家們的關(guān)注。

曾有研究人員利用Gateway重組克隆技術(shù)，構(gòu)建高通量基因沉默的載體系列pHELLSGATE，包括全部擬南芥基因組的ihpRNA轉(zhuǎn)基因系。還有科學(xué)家也根據(jù)Gateway技術(shù)開發(fā)了一種專門針對(duì)水稻基因組功能分析的RNA干擾載體-pANDA。還有用于高通量植物功能基因組構(gòu)建的載體系列，包括適合組成型表達(dá)、誘導(dǎo)型異常表達(dá)的GUS或GFP融合蛋白雙元載體，和以煙草花葉病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建的高通量VICS載體系列。