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單分子測序靈敏檢測5-hmC

日期:2011-11-24 08:52:12

甲基化研究如今開展得如火如荼。除了人們熟知的5-mC,很多研究人員也將目光轉向了另一種DNA修飾——5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)。5-hmC5-mC的羥基化形式,1952年在噬菌體DNA中首次發現。幾十年來,羥甲基胞嘧啶的研究一直圍繞著它對于噬菌體DNA的保護作用。直到最近,人們發現它與多個關鍵的細胞功能有關,包括胚胎干細胞發育、正常的骨髓細胞生成和受精卵發育。

 

若想深入了解5-hmC的生物學功能,必須開發出一種靈敏的測序方法,以揭示它在基因組中的位置。而現有的測序方法,如亞硫酸氫鹽測序,無法區分5-mC5-hmC。為此,美國芝加哥大學與Pacific Biosciences公司的研究人員合作,利用第三代單分子測序技術和5-hmC的選擇性化學標記方法來高通量檢測5-hmC。該研究成果于1120日發表在《Nature Methods》在線版上。

 

Pacific Biosciences公司開發的單分子實時(SMRTDNA測序是一種第三代的測序技術,它利用單個DNA聚合酶分子來開展DNA合成,并監控核苷酸的不斷摻入。核苷酸摻入的實時記錄,不僅產生了序列讀取,還帶來了關于聚合酶動力學的寶貴信息。通過這些信息,研究人員能鑒別DNA堿基的修飾。

 

一般來說,聚合酶在修飾堿基周圍的速率要比未修飾DNA慢。通過比較每個模板位點的摻入時間、脈沖間持續時間(IPD),可定量比較這一差異。利用這一方法,研究人員可直接檢測DNA甲基化,包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC5-hmC。聚合酶動力學的測定是SMRT測序的內在組成,不會對DNA一級序列的測定有任何不良影響。

 

研究人員還對5-hmC進行了選擇性化學標記。首先利用β-葡萄糖苷轉移酶為5-hmC引入疊氮修飾,之后通過點擊化學(click chemistry)反應安裝一個生物素標簽。通過這種方法,研究人員富集了基因組中的5-hmC,減少所需的測序量。此外,5-hmC上的大體積標簽在SMRT測序中產生了更大的動力學信號,以便在較低覆蓋度時更自信地指定修飾堿基。

 

為了檢驗這種方法的可行性,研究人員檢測了小鼠胚胎干細胞(mESC)中的5-hmC。在選擇性標記和富集之后,他們制備了SMRTbell DNA文庫,用于鳥槍法SMRT測序,并分析動力學信號。他們檢測到清晰的HS-N3-5-gmC信號。由于動力學信號的大幅增加,在單分子讀取中可輕松指定5-hmC的位點,而無需與未修飾的對照樣品進行比較。

 

作者認為,這種技術將是研究5-hmC生物學功能的有力方法。


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