蛋白質組技術的研究進展

日期：2011-08-26 09:43:56

大規模基因組測序計劃的實施已改變生命科學的重心，在相當短的時期內，一些原核生物和某些低等真核生物的基因組序列已被測定。1995年，流感嗜血桿菌基因組序列首次被破譯，在此后不到兩年的時間，近50個細菌的基因組序列已被完成。然而，這僅僅是理解有機物功能的一個起點。在基因組時代，許多DNA序列信息僅提供相關基因組的結構和功能。然而，對基因產物（mRNA和蛋白質）的理解是理解細胞生物學的一個不可缺少的部分。DNA序列信息不能預測：1)基因表達產物是否或何時被翻譯；2)基因產物的相應含量；3)翻譯后修飾的程度；4)基因剔除或過表達的影響；5)遺留的小基因或<300 bp的ORFs的出現；6)多基因現象的表型。此外，mRNA水平的測量并不能完全揭示細胞調節；且蛋白質的樣品較mRNA 穩定；蛋白質和mRNA之間的相關系數僅為0.4～0.5，還存在轉錄后加工、翻譯調節以及翻譯后加工等。故而，“基因組時代”的迅猛發展同時激起了人們對“后基因組時代”中蛋白質組研究的需求。

1 蛋白質組的含義

蛋白質組(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個基因組(genOME)，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(PROTein)。蛋白質組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環境狀態的不同而改變。在轉錄時，一個基因可以多種mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以許多形式進行翻譯后的修飾。故一個蛋白質組不是一個基因組的直接產物，蛋白質組中蛋白質的數目有時可以超過基因組的數目。

蛋白質組學(Proteomics)處于早期“發育”狀態，這個領域的專家否認它是單純的方法學，就像基因組學一樣，不是一個封閉的、概念化的穩定的知識體系，而是一個領域。蛋白質組學集中于動態描述基因調節，對基因表達的蛋白質水平進行定量的測定，鑒定疾病、藥物對生命過程的影響，以及解釋基因表達調控的機制。作為一門科學，蛋白質組研究并非從零開始，它是已有20年歷史的蛋白質(多肽)譜和基因產物圖譜技術的一種延伸。多肽圖譜依靠雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)和進一步的圖象分析；而基因產物圖譜依靠多種分離后的分析，如質譜技術、氨基酸組分分析等。

2 蛋白質組研究的核心用于分離的雙向電泳(2-DE)

蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心。雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1 000個E。coli 蛋白，并表明蛋白質譜不是穩定的，而是隨環境而變化。雙向電泳原理簡明，第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量的分離。目前，隨著技術的飛速發展，已能分離出10 000個斑點(spot。當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候，蛋白質組的分析變得可行。

樣品制備(sample prepareation)和溶解同樣事關2-DE的成效，目標是盡可能擴大其溶解度和解聚，以提高分辨率。用化學法和機械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白，兩者聯合有協同作用。對IEF(isoelectric focusing)樣品的預處理涉及溶解、變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物質。理想的狀態是人們應一步完成蛋白的完全處理。近來，在“變性劑雞尾酒”中，含14～16個碳的磺基甘氨酸三甲內鹽(ASB14～16 )的裂解液效果最好。而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉換。三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內的二硫鍵，增強了蛋白的溶解度，并導致轉至第二向的增加。兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度，作為互補試劑會更有效。在保持樣品的完整性的前提下，可利用超離和核酸內切酶去除核酸(DNA)。除此之外，機械力被用來對蛋白分子解聚，如超聲破碎等。另外，添加PMSF等蛋白酶抑制劑，可保持蛋白完整性。由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的，可在其水化的過程中加樣，覆蓋整個IPG膠，避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失。此外，低豐度蛋白(low abundance protein)在細胞內可能具有重要的調節功能，代表蛋白質組研究的“冰山之尖”，故分離低豐度蛋白是一種挑戰。亞細胞分級和蛋白質預分級、提高加樣量(已達到1～15 mg級的標準、應用敏感性檢測，可以提高其敏感性。如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術來分析和檢測。提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白(basic proteins)的分離是另一難點。由于堿性pH范圍內凝膠基質的不穩定及逆向電滲流(EOF)的產生，對PI(等電點)超過10的堿性蛋白，通過產生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之。亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質的穩定性。

2-DE面臨的挑戰是高分辨率和重復性。高分辨率確保蛋白最大程度的分離，高重復性允許進行凝膠間配比(match)。對2-DE而言，有3種方法分離蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技術為基礎。第一向應用載體兩性電解質(carrier ampholyte，CA)，在管膠內建立pH梯度。隨著聚焦時間的延長，pH梯度不穩，易產生陰極漂移。2)NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis用于分離堿性蛋白(pH>7.0)。如果聚焦達到平衡狀態，堿性蛋白會離開凝膠基質而丟失。因此，在等電區域的遷移須在平衡狀態之前完成，但很難控制。3)IPG-DALT發展于80年代早期。由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient，IPG的出現解決了pH梯度不穩的問題。IPG通過immobiline共價偶聯于丙烯酰胺產生固定的pH梯度，克服了IEF的缺點，從而達到高度的重復性。目前可以精確制作線性、漸進性和S型曲線，范圍或寬或窄的pH梯度。新的酸性pH 3～5或堿性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯合商品化的