DNA甲基化檢測的序曲——亞硫酸氫鹽轉化

日期：2011-06-16 08:46:18

檢測DNA甲基化的方法有很多種，在眾多方法中，研究人員常常會使用到一項技術，那就是亞硫酸氫鹽轉化。DNA的亞硫酸氫鹽處理將未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。隨后用測序、定量PCR和芯片等分析來比較處理和未處理DNA的序列，就能確定哪些堿基是甲基化的。

盡管在理論上很簡單，但亞硫酸氫鹽處理真正要做起來卻不那么容易。如果你問一問那些做過的人，他們八成會告訴你不好做。首先是回收率不高，會損失大量DNA，有時甚至達到50%。其次是轉化效率，有時是未能徹底轉化，有時則是轉化過了頭。此外，還要面臨DNA的降解。因為亞硫酸氫鹽處理的劇烈條件，DNA會片段化，從而降低了PCR及后續分析技術的靈敏度。

目前市場上有多個廠家提供亞硫酸氫鹽轉化試劑盒，包括QIAGEN、默克密理博、Sigma-Aldrich、Zymo、Life Technologies等。

在選購時，我們應注意關鍵的幾點。首先，確保所有的未甲基化CpG位點都能完全轉化，才能獲得可靠的結果。另外，我們還要關心DNA是否能夠高效回收。方法不同，實驗所需的時間也有差異。傳統的亞硫酸氫鹽轉化需要過夜孵育，而最新推出的試劑盒往往只需要1-3小時。

對于新手來說，最好還是買完整的試劑盒。試劑盒中的試劑和操作步驟經過優化，容易得到更加一致的結果。有些試劑盒中還帶有對照。有些人可能覺得對照可有可無，然而一旦出了問題，它的重要性就凸顯了。

默克密理博——CpGenome™ Turbo Bisulfite Modification Kit

這款極速重亞硫酸鹽處理試劑盒能為你帶來飛一般的感覺，讓你體驗極為快速的重亞硫酸鹽轉化。使用這一款極速重亞硫酸鹽處理試劑盒，從DNA樣品處理到轉化后的高純DNA只需90分鐘。它的秘密就在于一款受專利保護的處理試劑，能在很短時間內將未甲基化的胞嘧啶徹底轉化。同時這種試劑對DNA的傷害又極小，不像通常的高鹽、高溫以及低pH等極端條件會導致DNA高度片段化。至于這種處理試劑的成分，我們當然無從得知，只知道它是由兩種試劑混合而成。有了它，轉化即可在40分鐘內完成，耗時僅為其他方法的1/10。

也許你又有點擔心轉化的效果，快是快了，但會不會轉化不完全呢？其實，這款試劑盒的修飾轉化效率高達99.9%。無論是1 ng DNA，還是1 μg DNA樣品，極速重亞硫酸鹽處理試劑盒都一視同仁，產生靈敏且可靠的重亞硫酸鹽轉化結果。

有時，過度轉化也是一個大問題。不過，極速重亞硫酸鹽處理試劑盒可有一雙雪亮的眼睛，只會徹底轉化非甲基化的胞嘧啶，而絲毫不會轉化甲基化的胞嘧啶！研究人員做過實驗，用極速重亞硫酸鹽處理試劑盒處理甲基化DNA和非甲基化DNA，然后用CpG Wiz® MGMT引物對進行測序。結果顯示，在所有檢測的樣本中，極速重亞硫酸鹽處理試劑盒僅特異地徹底地轉化了非甲基化胞嘧啶，而完全沒有轉化甲基化胞嘧啶。這個特點最大限度地維護了我們實驗結果的真實性和準確性。

QIAGEN——EpiTect Bisulfite Kit

QIAGEN的EpiTect Bisulfite Kit 采用簡單的流程，可在6小時將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全轉化成尿嘧啶，且手工操作極少，而傳統方法需要18個小時。整個過程只需上樣、洗滌、洗脫這幾個簡單的步驟。DNA經過熱變性和亞硫酸氫鹽轉化后，被上樣到EpiTect分離柱或96孔板上，使用優化的緩沖液和標準化的離心步驟或真空裝置，洗去所有的亞硫酸氫鈉并洗脫DNA。洗脫的DNA可用于各種下游應用，如甲基特異性PCR，定量PCR分析，亞硫酸氫鹽測序，結合亞硫酸氫鹽的限制性內切酶法分析（COBRA）以及焦磷酸測序（Pyrosequencing）。

以往，研究人員總是為轉化效率太低而苦惱，而EpiTect Bisulfite Kit 采用全新的保護機制防止DNA降解，即使是1 ng的DNA也能獲得靈敏的結果，轉化率高達99%。而且試劑盒對不同的起始樣品量一視同仁，無論是低至1 ng的DNA，還是高至2 µg的DNA，試劑盒都以相同的效率轉化。對于微量樣本，轉化后的DNA還可用EpiTect Whole Bisulfitome Kit進行全基因組擴增。該試劑盒采用等溫多重代替擴增（MDA）技術，可從50 ng 亞硫酸氫鹽轉化后的DNA 擴增得到1-3 μg DNA，足夠下游100-300 次MSP實驗使用。

至于轉化之后的DNA回收，那向來是QIAGEN的拿手好戲。QIAGEN使用經典的硅膠膜技術，確保 85%以上的回收率，同時還可以高特異性地去除亞硫酸氫鹽等對后續PCR有抑制作用的組分。

此外，試劑盒中的DNA保護緩沖液也非同一般。它采用獨特的配方，防止DNA過度片段化，保證后續大PCR片段的擴增和分析，并實現有效的DNA變性，從而產生了轉化所需的單鏈DNA。這一有效的完整DNA回收確保轉化后的DNA可保存長達18個月，而如果使用自制試劑轉化DNA，則只能保存短短的2-4周。DNA保護緩沖液還包含有pH指示劑染料，從而保證胞嘧啶轉化時正確的pH條件。這款試劑盒的價格為2610元/48次，單次價格約為54元。

Sigma-Aldrich——Imprint® DNA Modification Kit

也許很多人都不知道，但Sigma-Aldrich真的提供了不少表觀遺傳學產品，包括亞硫酸氫鹽修飾、ChIP等試劑盒，只是比較低調，宣傳得不多而已。這款Imprint® DNA Modification Kit在性能上也確實不錯，只需2小時即可完成整個轉化步驟。DNA變性和亞硫酸氫鹽修飾是同時進行的。在修飾過程中，亞硫酸氫鹽與單鏈DNA反應，脫掉胞嘧啶的氨基，形成尿嘧啶。獨特的DNA保護試劑防止DNA的化學和熱降解。而捕獲溶液能讓DNA與過濾柱緊密結合，從而高效去除亞硫酸氫鈉和鹽。洗脫后的DNA立即可用，或儲存在-20°C，最多2個月。

說明書中提到，對于最佳的修飾，DNA量應當在50-200 ng之間，不過100 ng-1 μg的DNA也可成功修飾。它提供了兩種修飾步驟，供你靈活選擇。若DNA量較多，如10 ng-1 μg，可選擇一步法修飾；反之，若DNA在100 pg-10 ng之間，則推薦兩步法。BSA可作為載體蛋白，改善低濃度DNA的回收，不過試劑盒中未提供，需自己另購。

除了快，Imprint DNA Modification Kit也極為智能， 99%以上的未甲基化胞嘧啶都能轉化。至于處理和純化后的DNA回收率，一般在50%以上。修飾后的DNA可用于下游的甲基特異性PCR、焦磷酸測序和甲基化芯片。試劑盒中包含了轉化所需的所有試劑。50次反應的價格為2,577.51元，每次價格約為50元。

Zymo Research——EZ DNA Methylation™ kits

Zymo Research的DNA甲基化產品也是深受廣大科研工作者的喜愛。它提供了三款亞硫酸氫鹽轉化試劑盒：EZ DNA Methylation Kit、EZ DNA Methylation-Gold Kit和EZ DNA Methylation-Direct Kit。

EZ DNA Methylation-Gold Kit 是EZ DNA Methylation Kit的改進版。EZ DNA Methylation-Gold Kit 將 DNA 變性過程和亞硫酸氫鹽轉化過程合成一步，使整個過程更快，可在3小時內完成。此步驟采用溫度變性來取代之前方案中使用氫氧化鈉的化學變性過程。轉化之后，試劑盒可回收75%以上的DNA。

試劑盒的設計可以減少模板降解和純化過程中的DNA損失，并且完全轉化未甲基化的胞嘧啶。據Zymo介紹，轉化效率在99%以上。回收的DNA對于PCR擴增、限制性內切酶消化、測序、芯片等下游分析是很理想的。

若你的樣品量很少，Zymo還提供了另外一個好選擇——EZ DNA Methylation-Direct Kit。它能夠徹底轉化來自血液、組織、細胞、FFPE和LCM樣品中的DNA，而事先無需純化。這款試劑盒的靈敏度更高，即使10個細胞或50 pg DNA也能對付，DNA回收率在80%以上。與上面的EZ DNA Methylation-Gold Kit一樣，DNA 變性和亞硫酸氫鹽轉化是一步完成的。這幾款試劑盒都有離心柱和96孔板形式可供選擇。

Life Technologies——Cells-to-CpG™ Bisulfite Conversion Kit

Life Technologies的這一款試劑盒與上面Zymo的那個Direct有些類似，可以直接從細胞、組織或血液開始。直接裂解并變性樣品，隨后亞硫酸氫鹽轉化，脫鹽，脫磺酸基，整個步驟在3小時內完成。若是從純化的基因組DNA開始，需要100 ng至1 μg；對于培養的細胞，需要5000至105個；若是血液，則需要2.5 μl。

Cells-to-CpG™ 系統包含了從直接樣品轉化到純化所需的全部組分，提供了一個經過驗證、靈活簡化的亞硫酸氫鹽轉化方案，適合實時定量PCR、毛細管電泳和新一代測序的流程。試劑盒有兩種規格：50次反應和2×96孔板，供你靈活選擇。

除了這個試劑盒，Life Tech還提供了兩款對照，包括Cells-to-CpG™ Methylated and Unmethylated gDNA Control Kit和Cells-to-CpG™ Bisulfite Conversion & Quantitation Control Kit。結合這些經過驗證的對照，Cells-to-CpG™ Bisulfite Conversion Kit可為大家帶來定量上可靠的結果。

對于亞硫酸氫鹽轉化這個過程來說，我們的目標是實現未甲基化DNA到尿嘧啶的~100%轉化，同時最大限度地回收DNA。新產品的不斷出現，讓我們離這個目標越來越近了。