蛋白質凝膠電泳凝膠的制備

日期：2011-04-27 08:18:38

【材料與試劑】

（1）30%的丙烯酰胺：分別稱取29g 丙烯酰胺，1g N,N -亞甲雙丙烯酰胺加溫熱的去離子水60ml，加熱至37℃溶解，補加水至終體積為100ml,過濾，即配成30%（w/v）丙烯酰胺貯存溶液。丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過程中緩慢轉變為丙烯酸和雙丙烯酸，這一脫氨基反應是光催化或堿催化，故溶液的pH值不超過7.0，應置于棕色瓶中4℃保存。

（2）10%十二烷基硫酸鈉（SDS）：稱取10gSDS加去離子水90ml加熱至68℃，加幾滴濃鹽酸調節至pH7.2加水至100ml，即為10%（w/v）SDS。

（3）濃縮膠緩沖液（1mol/L Tris-HCl pH 6.8）：12.12g Tris溶解在80ml去離子水中，用濃鹽酸調節pH至6.8,再加去離子水至100ml。4℃保存。

（4）分離膠緩沖液（1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8）：18.16g Tris溶解在80ml去離子水中，用濃鹽酸調節pH至8.8, 再加去離子水至100ml。4℃保存。

（5）10%過硫酸胺（AP）：過硫酸胺提供催化丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基，可用去離子水配制小量10%（W/V）貯存液并4℃保存。由于過硫酸胺會緩慢分解，故應隔周新鮮配制。

（6）TEMED（N ， N ， N, N -四甲基乙二胺）TEMED通過催化過硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合，由于TEMED只能以游離堿的形式發揮作用，因此pH值較低時聚合反應受到抑制。

（7）Tris-甘氨酸電泳緩沖液：分別稱取15.1g Tris 和94g甘氨酸，溶解在900 ml去離子水中，然后加入50 ml 10%（w/v）SDS，再加去離子水至1000 ml則成5?貯存液。使用時稀釋5倍，終濃度Tris為25mmol/L、甘氨酸為250mmol/L、0.1%SDS，緩沖液pH為（8.3）。

（8）聚丙烯酰胺凝膠電泳槽和電泳儀

（9）加樣器和吸頭等

【操作方法】

（1）根據垂直電泳槽說明書安裝玻璃板，確定需配制分離膠的濃度和體積，按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠所用溶液”所列成分（見書末附錄）配制所需分離膠；

（2）迅速將分離膠注入兩玻璃板間隙中，留出灌注積層膠所需空間（梳子的齒長再加1cm，用滴管小心地在分離膠上覆蓋一層0.1% SDS（當丙烯酰胺濃度≤8%時）或異丁醇或水（當丙烯酰胺濃度≥10%時），覆蓋層可防止氧擴散進入凝膠而抑制聚合反應。將凝膠垂直置于室溫下；

（3）分離膠聚合完全后，倒出覆蓋層液體，用去離子水洗滌凝膠頂部數次以除去未聚合的丙烯酰胺，盡可能排除凝膠上的液體；

（4）確定需配制濃縮膠的體積，按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠所用溶液”（見書末附錄）配制所需濃縮膠，然后直接將濃縮膠灌注在分離膠上，立即插入干凈的配套梳子，避免氣泡，然后加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙。待濃縮膠聚合后，拔出梳子，形成加樣孔；

（5）用去離子水將Tris-甘氨酸電泳緩沖液貯存液稀釋5倍，倒入電泳槽，將加樣孔充滿，這時加樣孔中的氣泡可通過電泳緩沖液排除。