淺析梯度PCR

日期：2011-04-18 08:41:52

PCR技術從發明至今已有二十多年的時間，用于PCR實驗的儀器不斷的推陳出新。然而PCR的基本過程沒有太大變化，包括變性-退火-延伸這三步。當研究者進行PCR實驗獲得的結果不理想時，他們需要對PCR的組成要素進行優化。這其中包括反應條件、使用試劑的量甚至是引物等，在這里我們不一一介紹了。很多研究者在進行PCR優化時都會考慮退火溫度的優化，這時就會進行梯度PCR。而為什么要通過梯度PCR來優化以及如何解決梯度PCR優化后所不能解決的問題，這些對很多研究者來說可能并不是很清楚，本文中將會對此作一淺析。

梯度PCR是針對每臺PCR儀如何設置合適的退火溫度進行摸索。它是以合成引物的退火溫度為參考值，在進行同一個PCR反應時，同時設置多個退火溫度進行PCR實驗。這些退火溫度呈現梯度遞增或遞減，通過梯度PCR最終確定適合儀器的退火溫度。

雖然我們可以通過梯度PCR摸索出適合儀器的退火溫度，但在實際應用中仍然會遇到諸多困難。例如我們在一臺PCR儀上摸索出合適的退火溫度，當換到另一臺儀器（同一型號）上進行相同PCR實驗時，有時獲得的結果會不理想；在一臺PCR儀摸索出的退火溫度，換到其它品牌或型號的PCR儀上時，獲得的結果也是不理想；使用一種耗材獲得好的實驗結果，當更換其它耗材時，同樣獲得不理想的結果等。遇到上述狀況時，有時研究人員往往會很困惑，這是什么原因造成的？如何解決呢？

我們不禁要問，難道我們設計和合成引物時推薦的退火溫度不夠準確嗎？為什么還需要摸索適合儀器的退火溫度呢？帶著這些疑問，我們首先從PCR儀本身來了解一下出現上述問題的原因。我們知道在PCR儀上設置的溫度是模塊溫度，但由于受到模塊的材質及熱傳導效率、PCR反應管的厚度及與模塊貼合的緊密性等因素的影響，模塊的熱能不能100%傳遞到反應管中，這就導致了模塊溫度與反應管中的溫度的不一致性。例如銀質模塊會比鋁制模塊導熱性能好；薄壁的PCR管比厚壁的導熱性能高；另外，反應管與模塊的貼合的緊密程度來看，貼合越緊密導熱性能越好。圖中顯示出反應管與模塊之間存在一定的間隙這種情況會導致一定的熱量損失（圖1）。所以出現上述狀況的原因是由于模塊溫度與樣品溫度的不一致性造成的。

圖1. 模塊與反應管貼合示意圖

那究竟模塊溫度與樣品溫度存在多大差異呢？我們對PCR反應時模塊溫度與樣品內部溫度進行實時監測，并繪制出標準PCR儀的溫度曲線（圖2）。從圖中我們可以看出，變性溫度（95℃）下降到退火溫度這個過程時，模塊溫度與樣品溫度逐漸出現差異。當三種模塊（Block55/53/57）分別下降到退火溫度時，模塊溫度會進入平臺期，此時樣品溫度與模塊溫度出現如下的差異：當模塊溫度進入平臺期5秒鐘時，樣品與模塊溫度相差6.2℃；10秒鐘時相差3.0℃；15秒時相差1.5℃。由于樣品溫度要達到模塊溫度會出現一定的延遲，所以為解決這種延遲我們往往需要進行梯度PCR實驗，摸索出適合儀器的退火溫度。

圖2. △T = Temp.-difference between block setting and real sample temp.

但即使我們通過梯度PCR摸索出適合儀器的退火溫度后，在實際應用中仍需要再次進行梯度PCR。這主要是由于進行不同的PCR實驗和使用不同儀器和/或耗材進行PCR實驗時，模塊溫度與樣品溫度差異的不確定性所造成的。這樣我們就能夠了解進行梯度PCR的原因：不是由于獲得退火溫度理論值不準確，而是由于模塊溫度與樣品溫度的不一致性所造成。

眾所周知，引物的退火溫度可通過以下公式幫助您選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)，退火溫度=Tm值-(5～10℃)。因此，對于每一個PCR實驗都有一個理論的退火溫度值。如果PCR儀能夠保證較高的熱傳導效率，就可以保證模塊溫度與樣品溫度保持高度的一致性。這樣我們就無需進行梯度PCR實驗，只需使用退火溫度的理論值即可獲得理想的實驗結果。如圖3所示，可以看出這種PCR儀的模塊溫度和樣品溫度保持較好的一致性。當模塊進入退火溫度平臺期5秒鐘時，樣品與模塊溫度僅差0.5℃；10秒時相差0.3℃；15秒時相差0.15℃。所以這臺PCR儀設置的退火溫度便可以如實地反映出樣品溫度。

圖3. △T = Temp.-difference between block setting and real sample temp.

綜上所述，種種的問題主要是由于熱傳導效率的不同而導致樣品溫度和模塊溫度的差異以及這種差異的不確定性所造成的。梯度PCR摸索出的條件只有在PCR實驗、儀器、試劑和耗材等絕對一致時才是有效的，否則任何一個組成要素的改變又會帶來新的不確定性。顯然要徹底解決以上問題，研究人員需要一款能夠實現高效率的熱能傳導，并保持模塊溫度與樣品溫度高度一致的PCR儀來進行實驗。這時我們無需梯度PCR就可以解決模塊和樣品之間存在的溫度差異及差異的不確定性等諸多問題，同時這也大大簡化了PCR程序，更加省時、省試劑！