Nat methods:單細胞轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

日期：2011-04-12 08:32:27

基因表達是將基因攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)變?yōu)榭杀鎰e表型的整個過程，以DNA為模板合成RNA轉(zhuǎn)錄的過程是基因表達過程的第一步，也是基因表達調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)是通過在整體水平上研究細胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，將單細胞的基因型與表型聯(lián)系起來的一種強有力的方法。近日發(fā)表在《自然方法學》（Nature methods）的一篇最新論文中，作者詳細地綜述了單細胞轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)的歷史、進展、潛在應(yīng)用和未來的發(fā)展。

所謂轉(zhuǎn)錄組，廣義上講就是指單個細胞中轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA成分，而狹義上講則是指RNA聚合酶II活性的多聚腺苷酸產(chǎn)物。近年來高通量測序技術(shù)取得了日新月異的發(fā)展，科研人員通過RNA測序(RNA-seq)技術(shù)即可獲得高分辨率的單細胞轉(zhuǎn)錄組信息。利用這些信息科研人員能更深入地了解單細胞在決定細胞命運的關(guān)鍵階段對信號及其他環(huán)境因素產(chǎn)生反應(yīng)的機制以及獲得異常表型的時間。生物體中幾乎所有細胞都有著相同的基因型，然而在不同的細胞類型中反應(yīng)基因表達狀況的轉(zhuǎn)錄組卻受到細胞表觀遺傳學狀態(tài)的影響顯示出其獨特性。因而科學家們常以此來解析多細胞生物體發(fā)育過程中生理功能、行為及表型下的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

由于不同的細胞具有獨特的轉(zhuǎn)錄組，從理論上講轉(zhuǎn)錄組分析應(yīng)該在單細胞水平上開展。此外，這一分析還應(yīng)涵蓋單堿基分辨率下所有類型全長RNAs的準確序列、數(shù)量、定位、活性（例如活性轉(zhuǎn)錄或降解）以及修飾等信息。然而事實上，mRNA, rRNA, tRNA和小核RNA可能在成千上萬的不同位點有超過100個結(jié)構(gòu)各異的轉(zhuǎn)錄后修飾。且由于受到檢測的敏感度等技術(shù)限制，大部分轉(zhuǎn)錄組的研究還只能在幾十萬或上百萬個細胞水平上才能開展。在某些情況下由于無法收集大量的細胞，例如早期胚胎，使得轉(zhuǎn)錄組分析極其困難。

近期的研究表明即使在極其相似的細胞類型中基因表達也常常顯示異質(zhì)性。這種轉(zhuǎn)錄組的隨機變異對于細胞的命運起著重要的決定作用。例如近期哈佛大學的Sunney Xie和同事們證實隨機的單分子事件可啟動單個細菌細胞的表型轉(zhuǎn)換。轉(zhuǎn)錄組的差異還可提供疾病組織中細胞類型組成的關(guān)鍵信息，例如包含少量癌癥干細胞的腫瘤。在相似細胞類型中基因表達的異質(zhì)性有可能是受到了基因組表觀遺傳學狀態(tài)、生物鐘、細胞周期、細胞微環(huán)境以及內(nèi)在轉(zhuǎn)錄“噪音”等差異的影響。事實上，從細菌到人類的所有模型生物體中基因表達均具有隨機性。這一部分是由于單個細胞的大多數(shù)基因中，基因組DNA模板僅有一個（原核生物）或兩個（大多數(shù)真核生物）拷貝用于轉(zhuǎn)錄，且啟動表達的分子事件本身具有隨機的特性。為了了解基因表達異質(zhì)性和隨機性的基礎(chǔ)及重要性，非常有必要在單個細胞中對轉(zhuǎn)錄組進行檢測。

單細胞轉(zhuǎn)錄組分析的歷史

早在20多年前Norman Iscove就率先利用PCR指數(shù)擴增單細胞cDNAs的方法在單細胞水平上開展了轉(zhuǎn)錄組分析。隨后，James Eberwine又利用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄（IVT）對cDNAs進行了線性擴增。這些技術(shù)幫助科學家們更深入地了解了哺乳動物神經(jīng)細胞發(fā)育及功能分子機制。

圖1：單細胞轉(zhuǎn)錄組分析的策略

實線代表實驗已證實的策略；虛線則表示未來有可能實現(xiàn)的策略。

而后，高密度DNA芯片的商業(yè)化應(yīng)用進一步推動了單細胞微陣列技術(shù)的發(fā)展。然而盡管這一技術(shù)具有高效性，可用于獲得全基因組基因表達模式，但擴增的cDNA片段一般較短（幾百個堿基對），且不能用于檢測選擇剪接生成的轉(zhuǎn)錄物。目前這一技術(shù)僅適用于檢測已知基因。

單細胞轉(zhuǎn)錄組分析的應(yīng)用

單細胞轉(zhuǎn)錄組分析可用于確定全基因組范圍基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可與目的基因過表達、敲除或沉默技術(shù)合并用于揭示靶細胞中基因表達調(diào)控機制。尤其是用于分析早期胚胎發(fā)育過程中干細胞與細胞的分析因為這些細胞亞群具有高動態(tài)和異質(zhì)性特征。此外，由于基因表達的隨機性特性可顯著地影響單個細胞的命運及表型。解析細胞群中基因表達的異質(zhì)性亦是單細胞分析的重要研究方向。例如在胚胎干細胞中基于Nanog, Rex1 或 Stella的表達情況即可了解細胞亞群的異質(zhì)性。

單細胞轉(zhuǎn)錄組分析的另一個應(yīng)用方向則是確定不同亞細胞室區(qū)的基因表達譜。眾所周知在神經(jīng)元中mRNAs需從細胞體活性轉(zhuǎn)運至軸突或樹突進行翻譯。單細胞轉(zhuǎn)錄組分析可用于檢測在軸突或樹突特異性定位的mRNAs，從而用于確定這些神經(jīng)元的生理功能。

由于新一代測序技術(shù)可提供單堿基分辨率的信息，單細胞轉(zhuǎn)錄組分析還可用于分析單個細胞中等位基因特異性的基因表達，以鑒別兩等位基因間的單核苷酸多態(tài)性。這將有助于我們深入了解單個細胞中遺傳元件與表觀遺傳學元件影響等位基因特異性表達的機制。