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“瘦肉精門”拷問科學家的良知

日期:2011-04-06 16:05:38

(一)根據配體特異性的分離方法-親和色譜法

親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質的一種極為有效的方法,它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來,而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價地結合。其基本原理:蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質,因此蛋白質的分離(Separation),提純(Purification)和鑒定(Characterization)是生物化學中的重要的一部分,至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來,因此往往采取幾種方法聯合使用。

(二)根據蛋白質分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾

透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。

超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質分子通過半透膜,而蛋白質留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。

2、凝膠過濾法

也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。

(三)根據蛋白質帶電性質進行分離

蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同,可將其分開。

1、電泳法

各種蛋白質在同一pH條件下,因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質作為載體,電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時,到達各自等電點的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質。

2、離子交換層析法

離子交換劑有陽離子交換劑(如:羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素),當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。

(四)根據蛋白質溶解度不同的分離方法

1、蛋白質的鹽析

中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質的溶解度增加,此稱鹽溶;當鹽濃度繼續升高時,蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質分子的水化層,使之“失水”,于是蛋白質膠粒凝結并沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由于各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉淀。

影響鹽析的因素有:(1)溫度:除對溫度敏感的蛋白質在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低,更容易鹽析。(2)pH值:大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。(3)蛋白質濃度:蛋白質濃度高時,欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉淀出來(共沉現象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質含量在2.5-3.0%。

蛋白質鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨,它的優點是溫度系數小而溶解度大(25度時飽和溶液為4.1M,即767克/升;0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升),在這一溶解度范圍內,許多蛋白質和酶都可以鹽析出來;另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當用其他pH值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調節。

蛋白質在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質溶液裝入秀析袋內(常用的是玻璃紙),用緩沖液進行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短。

2、等電點沉淀法

蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質的等電點有差別,可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉淀,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用。

3、低溫有機溶劑沉淀法

用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數蛋白質溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質較易變性,應在低溫下進行。

(一)根據配體特異性的分離方法-親和色譜法

親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質的一種極為有效的方法,它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來,而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價地結合。其基本原理:蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質,因此蛋白質的分離(Separation),提純(Purification)和鑒定(Characterization)是生物化學中的重要的一部分,至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來,因此往往采取幾種方法聯合使用。

(二)根據蛋白質分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾

透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。

超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質分子通過半透膜,而蛋白質留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。

2、凝膠過濾法

也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。

(三)根據蛋白質帶電性質進行分離

蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同,可將其分開。

1、電泳法

各種蛋白質在同一pH條件下,因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質作為載體,電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時,到達各自等電點的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質。

2、離子交換層析法

離子交換劑有陽離子交換劑(如:羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素),當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。

(四)根據蛋白質溶解度不同的分離方法

1、蛋白質的鹽析

中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質的溶解度增加,此稱鹽溶;當鹽濃度繼續升高時,蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質分子的水化層,使之“失水”,于是蛋白質膠粒凝結并沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由于各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉淀。

影響鹽析的因素有:(1)溫度:除對溫度敏感的蛋白質在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低,更容易鹽析。(2)pH值:大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。(3)蛋白質濃度:蛋白質濃度高時,欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉淀出來(共沉現象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質含量在2.5-3.0%。

蛋白質鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨,它的優點是溫度系數小而溶解度大(25度時飽和溶液為4.1M,即767克/升;0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升),在這一溶解度范圍內,許多蛋白質和酶都可以鹽析出來;另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當用其他pH值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調節。

蛋白質在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質溶液裝入秀析袋內(常用的是玻璃紙),用緩沖液進行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短。

2、等電點沉淀法

蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質的等電點有差別,可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉淀,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用。

3、低溫有機溶劑沉淀法

用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數蛋白質溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質較易變性,應在低溫下進行。

沸沸揚揚的瘦肉精事件再起波瀾:國內“瘦肉精”最初源頭來自一位浙江大學曾任農業部飼料與動物營養重點開放實驗室主任的許梓榮教授,據稱這位教授1987年在美國弗吉尼亞大學當訪問學者,回國后寫了關于“瘦肉精”的論文,被列為國家科委“八五”攻關項目。

在80年代中旬未知其危害前,“瘦肉精”(當時是鹽酸克倫特羅)項目由于符合了培養瘦肉型豬的要求,作為優秀項目引入中國成為八五攻關項目本來無可厚非,但是重點在后面,1989年西班牙相繼出現了中毒事件,之后法國,意大利,美國也出現了此類事件,因此相繼禁止了鹽酸克倫特羅的使用。作為攻關這一領域的主要科學家,理應保持對這一領域發展動態的關注,就不應該不知道歐洲,美國都禁止了鹽酸克倫特羅用于。。。那么這個時候這些相關的科研人員做了什么呢?在耗費多年心血刻苦研究剛剛取得成功,數不清的榮譽正在在召喚,還有極其巨大的經濟效益已經在招手的時刻,突然發現這一切可能頃刻化為烏有的時候,他們做出了怎樣的選擇呢?

有三種可能,一是向上級匯報了歐美相繼發現鹽酸克倫特羅中毒事件而先后被禁用于飼料,反對對其研究成果進行推廣。但是由于其他人在巨大既得利益的驅使下,隱瞞或者無視其建議,繼續推廣其研究成果而造成瘦肉精最終泛濫失控,造成了“被隱瞞”;另外的可能二是選擇了沉默,即不匯報,也不推廣,以轉換課題來逃避,默認事態的發展,三是明知并隱瞞其危害和被禁用的事實,為利益或者榮譽而昧著良心繼續大力促進“瘦肉精”的推廣。。。。。。

事實的真相是什么,恐怕只有當事人站出來澄清才有答案。

但是我們注意到在1995年許梓榮還在《浙江農業大學學報》上發表了題為“Clenbuterol對肥育豬作用效果的研究”的文章(Clenbuterol即克侖特羅),文章中闡述了Clenbuterol在促進豬瘦肉增多方面的作用,而且沒有任何文字提到了其副作用,而當時歐洲等地早就報道了相關的中毒事件,作為這一領域的國內領銜科學家,難道說這位教授真的不知道嗎?

如果說真不知道國外的情況,那么在1997年國內已經禁止了輸港豬肉瘦肉精的使用的前提下,1998年許梓榮還在“第三屆全國飼料營養學術研討會”上作出了題為“Clenbuterol和Ractopamine對肥育豬肉質的影響”的報告,文章也沒有只字提及相關不良作用。

確實,面對付出了多年心血,即將產生大量商業價值的科研成果,眼看著巨大利益在招手,試問有多少人在這個時候能有勇氣剎住車,停下來指出自己之前做的東西可能是有害的,讓自己的心血付諸東流?在這個沒有資助可能連實驗室都混不下去的現實社會中,科學家的良知,在巨大的經濟利益和社會榮譽面前,到底應該有多少分量?

如果當時這位教授站了出來,高聲疾呼“瘦肉精”的危害,即使他也許再也找不到這樣好的科研轉化成果,也許再也不可能得到眾多的科技獎勵,但是這樣的科學家可以說代表了中國的脊梁!將贏得成千上萬人的尊重,在科研道德發展史上留下濃厚的一筆!

當今的社會紛紛攘攘,急功近利,浮躁的商業行為直逼最貼近民生的食品行業,從最開始添加甲醇的假酒,到著名的蘇丹紅事件,從引發奶業整個行業震動的三聚氰胺事件,到利用“孔雀綠”處理多寶魚,利用避孕藥催熟的黃鱔,這些等等事件中都不乏有學術人員的推波助瀾——畢竟在第一線上的農民,或養殖業人員大部分都不會知道進行這樣的處理。

那么這些參與的學術人員不了解此類做法的危害嗎?不,怎么可能不知道呢,但是在巨大的利益誘惑的面前,他們違背了自己的科研良知,放棄了道德準則,在出現了各種中毒事件后,他們可有一絲悔改?

逝者如斯,過往已發生,我們希望的是在未來的日子里,不會再出現更多的××精,××胺,也希望科研人員能謹守科研良知,尊重自己和科學。

后續報道:

據齊魯晚報報道,克倫特羅被禁后,許梓榮對β-興奮劑作為飼料添加劑的研究并未停止,他將目光轉向了萊克多巴胺(RactoPamine)。  萊克多巴胺是“瘦肉精”中克倫特羅的最佳替代品,其被禁亦稍晚于克倫特羅,中國在2002年明確將其列入《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》。

1996年到1999年,許梓榮作為主要作者,發表了多篇萊克多巴胺提高豬瘦肉率的論文,在這些論文中提到了主要副作用:引起動物腿疾。這些論文大多得到了國家科委的資助。事實上目前科研界仍然有為萊克多巴胺“正名”的呼聲,然而萊克多巴胺的副作用明顯且觸目:在美國,一些服用萊克多巴胺的豬不能站立和行走。


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