外顯子組測序發現白血病中的關鍵突變

日期：2011-03-31 10:56:07

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院上海血液學研究所的陳竺院士和陳賽娟院士領導的研究小組近日在《Nature Genetics》上發表了一篇文章。他們利用外顯子組測序（exome sequencing），發現了急性單核細胞白血病（AML-M5）中的DNA甲基轉移酶基因DNMT3A突變。

盡管近年來一些研究發現抑癌基因甲基化在急性白血病中普遍存在，然而由于常規的全基因組測序技術存在著工作量大、耗時長、成本高等局限，使得目前只有少數基因的甲基化狀態被確定與患者的臨床特征即預后有關。外顯子組測序是一種新型的基因組分析技術。由于外顯子組僅占人類基因組的百分之一。測定外顯子序列只需針對外顯子區域的DNA即可，因此遠比全基因組測序更簡便、經濟，近年來也開始廣泛應用到遺傳病的相關研究中。

在這項研究中，研究人員首先利用Ficoll梯度離心從9個AML-M5病例的骨髓樣本及對照外周血中分離出單核細胞，然后從新鮮制備的細胞中抽提出基因組DNA，用于外顯子組測序。

外顯子組捕獲是在羅氏NimbleGen的2.1M人外顯子組芯片上開展的。此款芯片包含210萬個探針，最多能捕獲50 Mb區域。研究人員從每個外顯子組中捕獲出24 Mb區域。隨后通過連接介導的PCR擴增這些片段，純化后就交予Illumina平臺開展DNA測序。

簇生成是在Illumina的簇生成工作站上開展的，流程如下：模板雜交、等溫擴增、線性化、阻斷、變性和測序引物雜交。之后，研究人員利用Illumina的Genome Analyzer IIx平臺（GAIIx）對捕獲的文庫開展深度測序。定向區域中每個堿基的平均覆蓋度為100倍，且這些堿基中的95.3%有著足夠深的覆蓋度（>10倍），能夠進行變異體檢出。

研究人員利用內部的軟件系統，將骨髓外顯子組數據組中鑒定出的變異體與dbSNP和外周血對照中存在的種系變異相比較。他們鑒定出266個潛在的體細胞序列改變，包括220個單核苷酸變異（SNV）和46個小的插入或缺失（indel）。

之后，研究重點放在一些可能會影響蛋白編碼序列的變化上，包括59個非無義替換和10個影響ORF完整性的indel上。對了驗證，他們利用PCR直接從原始樣本中擴增出相應的基因組區域，并開展Sanger測序。其中98.3%（58個）SNV被證實為體細胞突變，而80%（8個）indel被證實。至此，他們鑒定出63個基因中的66個體細胞突變，其中3個基因包含兩種情況。

接下來，他們對另外5個病例（無配對正常樣本）開展了外顯子組測序，著重研究那63個基因。為了排除稀有SNP，他們又對509個對照樣本進行了分析。之后，研究人員對另外98個病例（M5驗證組）的骨髓DNA樣本進行基因分型。結果，他們在14個基因中發現了體細胞突變或很可能的體細胞突變，每個突變都至少在兩個病例中檢測到。

通過上述數據的整合，并綜合文獻研究，研究人員選擇出6個基因（DNMT3A, NSD1, GATA2, CCND3, ATP2A2 和C10orf2），并對M5驗證組中它們的編碼區域進行測序。在編碼DNA甲基轉移酶的DNMT3A中，研究人員鑒定出多個變異，其中p.Arg882His、p.Arg882Cys和 p.Val897Asp被證實由體細胞突變產生，而p.Arg478Trp、p.Gly543Cys和p.Arg882Ser不存在與對照驗證組中，因此很可能是由體細胞突變產生。這樣，112個病例中的23例存在DNMT3A突變，突變頻率為20.5%。

DNMT3A突變體功能分析結果顯示酶活性減少，或與組蛋白H3的親和力異常。值得一提的是，研究人員證實DNMT3A突變樣本中的DNA甲基化模式和/或基因表達譜均發生了改變。DNMT3A突變與急性白血病高發病率及預后不良有著密切的關系。此外，研究人員還在篩查其他白血病亞型時發現13.6%的急性粒細胞白血病（AML-M4）的病例存在Arg882改變。

這一研究發現證實了異常的DNA甲基化轉移酶活性與急性單核細胞性白血病發病密切相關，并為疾病的診斷和預后評價提供了一個有潛力的生物標記。

大規模并行測序技術的開發讓癌癥的突變測定變得可行，然而，全基因組測序工作量大，耗時長，成本高，關鍵是數據分析也相當復雜，面對海量的數據，你根本無從下手。外顯子組捕獲工具的出現，讓致病基因的發現變得簡單。科學家們普遍認為外顯子組測序比全基因組測序更有優勢，不僅僅是費用更低，數據的闡釋也更為簡單。

在過去的兩年內，研究人員利用外顯子組測序，發現了多種孟德爾疾病及更為復雜疾病（如癌癥）的關鍵基因。這種技術也被《Science》雜志評為2010年十大科學突破。如今，新一代測序的費用越來越低，序列捕獲的產品也越來越豐富，使得外顯子組測序的門檻越來越低。相信在不久的將來，國內也能利用這種技術發現更多疾病的秘密。