單分子熒光分析技術(shù)揭示解旋酶作用機(jī)制

日期：2010-08-23 16:49:01

來自伊利諾斯大學(xué)大學(xué)，加州大學(xué)伯克利分校，霍華德休斯醫(yī)學(xué)院等處的研究人員利用一種單分子熒光分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)了重要的DNA解旋酶：Bacillus stearothermophilus PcrA的作用機(jī)制。這一研究成果公布在Cell雜志上。

領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是伊利諾斯大學(xué)大學(xué)，HHMI知名的研究員Taekjip Ha教授，這位2005年加入HHMI的科學(xué)家專注于DNA與蛋白相互作用過程中的生物物理學(xué)分析，揭示了許多包括DNA修復(fù)，酶作用過程機(jī)制。

類似解旋酶的蛋白與核酸相互位置的轉(zhuǎn)變具有重要的細(xì)胞生物學(xué)意義，但是至今科學(xué)家們還并不清楚這個(gè)過程如何解開DNA結(jié)合蛋白，而且這一過程的基本特征迄今為止仍然倍受爭(zhēng)議。

DNA修復(fù)指雙鏈DNA上的損傷得到修復(fù)的現(xiàn)象，這個(gè)過程可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新能執(zhí)行它原來的功能，DNA修復(fù)是探索生命的一個(gè)重要方面，而且與遺傳疾病、腫瘤學(xué)等密切相關(guān)。對(duì)不同的DNA損傷，細(xì)胞可以有不同的修復(fù)反應(yīng)。

DNA解鏈酶在DNA不連續(xù)復(fù)制過程中，結(jié)合于復(fù)制叉前面，催化DNA雙鏈結(jié)構(gòu)解鏈，并具有ATP酶活性的酶，兩種活性相互偶聯(lián)，通過水解ATP提供解鏈的能量。不同來源的DNA解旋酶的共同特性是通過水解ATP提供解鏈的能量，而復(fù)制叉結(jié)構(gòu)的存在與否對(duì)活性的影響因酶而異。

在這篇文章中，研究人員利用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）解析了這一過程，如下圖所示，這種PcrA螺旋酶通過2B位點(diǎn)結(jié)合在模板鏈上，沿著滯后鏈滑動(dòng)，形成一個(gè)單鏈環(huán)，從而反復(fù)的，統(tǒng)一步驟的完成功能。這個(gè)過程需要PcrA開放性的結(jié)構(gòu)，能快速的替換RecA，這為分析DNA復(fù)制過程提供了一種新模型。

這個(gè)過程使用了兩種染料，這些染料熒光強(qiáng)度可根據(jù)它們之間的靠近距離發(fā)生改變。研究人員將兩種染料分別連接到單鏈DNA的兩個(gè)末端，從而能直接觀察到DNA鏈的作用方式，他們發(fā)現(xiàn)這兩種染料能相互靠近，然后又分開，這樣重復(fù)，其中PcrA并沒有沿著單鏈尾部移動(dòng)，而是與DNA鏈斷裂端結(jié)合，拉動(dòng)DNA使之與結(jié)合蛋白分離。當(dāng)這一過程結(jié)束的時(shí)候，PcrA就會(huì)松開。

這里運(yùn)用到的單分子熒光技術(shù)實(shí)際上就是大家熟悉的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，這種技術(shù)是指當(dāng)兩種不同的熒光生色團(tuán)離的較近，且其中一種生色團(tuán)（供體, donor）的發(fā)射譜與另一種生色團(tuán)（受體, acceptor）的激發(fā)譜有相當(dāng)程度的重疊時(shí)，當(dāng)供體被激發(fā)時(shí)，受體會(huì)因供體激發(fā)能的轉(zhuǎn)移而被激發(fā)。其直觀表現(xiàn)就是供體產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度較其單獨(dú)存在時(shí)要低的多，而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)，同時(shí)伴隨它們熒光壽命的相應(yīng)縮短和延長(zhǎng)。

這種技術(shù)是目前研究蛋白質(zhì)相互作用比較成熟、已被廣泛應(yīng)用的幾種方法之一，而用于DNA與蛋白之間的相互作用關(guān)系研究則是近年來動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。

用單分子熒光光譜技術(shù)研究生物分子構(gòu)象變化的方法主要有兩種：一是通過單分子熒光偏振的各向異性（ single molecule fluorescencepolarization anisotropy，smFPA）研究生物分子的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)(conformational dynamics)和旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)(rotational motions)。另一個(gè)是單分子對(duì)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(single pair fluorescence resonance energytransfer, spFRET)，在單分子水平測(cè)量一個(gè)分子內(nèi)或兩個(gè)不同分子間的距離變化和相互作用。

在幾年前，Taekjip Ha教授研究組就利用這一方法研究分析了DNA解旋酶，他們用熒光染料做上了標(biāo)記：給Rep（DNA解旋酶中作為引擎的那部分結(jié)構(gòu)）加上了綠色熒光蛋白，給DNA鏈末端加上了紅色熒光蛋白，觀測(cè)一個(gè)熒光分子如何傳遞能量給另一個(gè)從而獲知被標(biāo)記的分子相對(duì)于另一個(gè)被標(biāo)記的分子是如何運(yùn)動(dòng)的。

研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)Rep靠近到DNA鏈末端阻隔時(shí)，這個(gè)酶并沒有停在那兒而是跳回到了DNA鏈的開端重新開始，如果仍然“讀”不過去，Rep就會(huì)重復(fù)這個(gè)過程。這也是Taekjip Ha教授利用FRET成功分析DNA復(fù)制過程的一個(gè)范例。

單分子FRET是對(duì)單個(gè)分子的熒光特性進(jìn)行檢測(cè)的過程，因?yàn)閹缀跛械姆肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果只代表測(cè)量時(shí)間內(nèi)大量分子的平均行為 ,而生物體系一般來說都是不均勻體系 ,尤其對(duì)于生物大分子而言。因此監(jiān)測(cè)單個(gè)生物大分子的行為具有重要意義。

FRET最基本的原理是通過易于檢測(cè)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率信息來反映兩分子團(tuán)的距離信息，而距離接近到 10 nm之間是兩分子相互作用或一個(gè)分子的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域因構(gòu)象改變而相互靠近的有力證據(jù)。通過 FRET效率的增強(qiáng)可檢測(cè)分子間發(fā)生相互作用或構(gòu)象改變而靠近;FRET效率的減弱可用于證明兩分子遠(yuǎn)離因而失去相互作用，或證明一個(gè)分子的兩個(gè)部分間因分子被切斷或構(gòu)象改變而相互遠(yuǎn)離。

在分子水平上研究任何生物學(xué)機(jī)制都可以運(yùn)用FRET技術(shù)，關(guān)鍵在于找到合適的熒光探針和檢測(cè)設(shè)備。事實(shí)上FRET方法的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛。近年來在核蛋白機(jī)制、細(xì)胞外基質(zhì)、生物膜功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)方向領(lǐng)域都可以找到FRET技術(shù)的應(yīng)用案例。這一技術(shù)無疑已成為細(xì)胞分子機(jī)制研究的重要工具。