蛋白質(zhì)純化與結(jié)晶的原理

日期：2010-08-02 13:57:26

獲得蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)的第一個(gè)瓶頸，就是制備大量純化的蛋白質(zhì)（>10mg），其濃度通常在10mg/ml 以上，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選。運(yùn)用重組基因的技術(shù)，將特定基因以選殖（clone）的方式嵌入表現(xiàn)載（expressionvector）內(nèi)，此一載體通常具有易于調(diào)控的特性。之后再將帶有特定基因的載體送入可快速生長的菌體中，如大腸桿菌（Escherichia coli），在菌體快速生長的同時(shí)，也大量生產(chǎn)表現(xiàn)載體上的基因所解譯出之蛋白質(zhì)。一般而言純度越高的蛋白質(zhì)比較有機(jī)會形成晶體，因此純化蛋白質(zhì)的步驟就成為一個(gè)重要的決定因素。

在取得高純度的蛋白質(zhì)溶液后，接下來就是晶體的培養(yǎng)。蛋白質(zhì)晶體與其他化合物晶體的形成類似，是在飽和溶液中慢慢產(chǎn)生的，每一種蛋白質(zhì)養(yǎng)晶的條件皆有所差異，影響晶體形成的變量很多，包含化學(xué)上的變量，如酸堿度、沈淀劑種類、離子濃度、蛋白質(zhì)濃度等；物理上的變數(shù)，如溶液達(dá)成過飽和狀態(tài)的速率、溫度等；及生化上的變數(shù)，如蛋白質(zhì)所需的金屬離子或抑制劑、蛋白質(zhì)的聚合狀態(tài)、等電點(diǎn)等，皆是養(yǎng)晶時(shí)的測試條件。截至目前為止，并無一套理論可以預(yù)測結(jié)晶的條件，所以必須不斷測試各種養(yǎng)晶溶液的組合后，才可能得到一顆完美的單一晶體。

蛋白質(zhì)晶體的培養(yǎng)，通常是利用氣相擴(kuò)散法（Vapor Diffusion Method）的原理來達(dá)成；也就是將含有高濃度的蛋白質(zhì)（10-50 mg/ml）溶液加入適當(dāng)?shù)娜軇档偷鞍踪|(zhì)的溶解度，使其接近自發(fā)性的沈淀狀態(tài)時(shí)，蛋白質(zhì)分子將在整齊的堆棧下形成晶體。舉例來說，我們將蛋白質(zhì)溶于低濃度（~1.0M）的硫酸銨溶液中，將它放置于一密閉含有高濃度（~2.0M）硫酸銨溶液的容器中，由氣相平衡，可以緩慢提高蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨的濃度，進(jìn)而達(dá)成結(jié)晶的目的。

蛋白質(zhì)晶體在外觀上與其他晶體并無明顯不同之處，但在晶體的內(nèi)部，卻有很大的差異。一般而言，蛋白質(zhì)晶體除了蛋白質(zhì)分子外，其他的空間則充滿約40%至60%之間的水溶液，其液態(tài)的成分不僅使晶體易碎，也容易使蛋白質(zhì)分子在晶格排列上有不規(guī)則的情形出現(xiàn)，造成晶體處理時(shí)的困難及繞射數(shù)據(jù)上的搜集不易等缺點(diǎn)。但也由于高含水量的特性，讓蛋白質(zhì)分子在晶體內(nèi)與水溶液中的狀態(tài)，極為相似。所以由晶體所解出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，基本上可視為自然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。