攜帶多個目的基因的重組腺病毒的制備
日期：2010-06-25 11:10:10
目的基因的獲取：
（1）特定細胞表達的目的基因：提取RNA后進行反轉錄，PCR擴增；
（2）載體中含有的目的基因：酶切或PCR獲取；
（3）融合蛋白基因：根據需求，進行PCR合成目的基因；
2、穿梭質粒的構建：
（1）攜帶目的基因的穿梭質粒的構建：通過酶切、連接的方式得到，一般采用的是pShuttle-cmv載體；
（2）攜帶多個目的基因的穿梭質粒的構建：如同時表達兩個目的基因，可通過IRES將兩個目的基因相連；
（3）攜帶干涉序列shRNA的穿梭質粒：首先將H1啟動子構建到pShuttle質粒上，然后將目的基因克隆到H1啟動子下游；
3、重組腺病毒質粒構建：
攜帶目的基因的穿梭質粒線性化后與Adeasy-1共轉BJ5183感受態細胞（電轉），篩選得到重組腺病毒質粒，并經PacI酶切鑒定：可見目的質粒出現兩條條帶，分別為3.0kb或4.5kb和>23Kb兩條條帶。 將得到的重組腺病毒質粒轉染DH5a感受態細胞，以便于保存。
4、重組腺病毒的制備：
將PacI酶切線性化的高純度高濃度重組腺病毒質粒，以脂質體介導的方式轉染293細胞，7～10天出現噬斑，待完全病變后，收集細胞和上清，于-70℃保存。
5、重組腺病毒的鑒定
在基因水平，提取腺病毒基因組DNA，采用目的基因的引物，PCR擴增病毒基因組DNA；并采用相應的引物，檢測是否含有復制型腺病毒。
在蛋白水平，分泌蛋白，采用ELISA檢測目的基因的表達；膜蛋白采用流式方法進行檢測；其他蛋白采用Western-blot方法進行檢測。
6、病毒擴增及純化：
根據實驗的需要擴增重組腺病毒（細胞實驗20～40皿；動物實驗60～80皿），并采用氯化銫密度梯度離心法進行純化，純化得到的病毒用10％甘油保存。
7、病毒滴度測定：
紫外分光光度法檢測病毒的OD260和280值：根據OD260nm可推算病毒的顆粒滴度； OD260nm/OD280nm代表病毒的純度。
同時，采用快速CPE和TCID50測定病毒的感染滴度。 
