一種構建重組質粒的簡便方法
日期：2010-05-17 16:50:54
克隆的道路有很多條，比如TA克隆、不依賴連接反應的克隆（LIC）、重組酶依賴的克隆等等。TA克隆和LIC都需要末端修飾，而這種修飾不容易被凝膠電泳等技術檢測。重組酶通常又是和克隆試劑盒捆綁銷售的，因此研究人員也很難優化重組反應。于是，美國艾默里大學生物化學系的Anton V. Bryksin和Ichiro Matsumura開發出一種PCR介導的克隆方法-重疊延伸PCR克隆（Overlap extension PCR cloning），相當簡單且可靠。
克隆過程如下：一開始用嵌合體引物進行PCR擴增，產生了線性的插入片段，且片段兩端都有載體序列。然后將載體和插入片段混合，變性并退火，隨后將載體作為模板，用Phusion DNA聚合酶延伸雜交后的插入片段，直到聚合酶到達插入片段的5’端。在幾輪PCR循環后，反應的終產物是帶有兩個缺口（每條鏈一個）的雙鏈融合質粒。利用DpnI限制性內切酶消化，除去母板質粒，新質粒則轉化到大腸桿菌中，DNA修復酶將缺口封住。
研究人員在反應中使用的是NEB公司的Phusion DNA聚合酶，他們認為這很關鍵，因為此酶保真度高，且不擁有鏈置換活性。研究人員還比較了五種不同的DNA聚合酶，認為這個最好。反應中只需要DNA聚合酶，而不再需要操作多個限制性內切酶、重組酶、連接酶和糖基化酶等。
在原理驗證的實驗中，研究人員首先克隆了gfp。他們認為，高濃度的插入片段和相對低的退火溫度（比計算出的退火溫度低5-10°C）對于高效的重疊延伸是很重要的。轉化后的重組子有98%以上呈綠色，說明克隆錯誤和原始載體的殘留極低。
研究人員還比較了PCR循環數對克隆效率的影響。他們發現：在最初15個循環，重組克隆數量不斷增加，在17-18個循環達到高峰。之后的循環導致克隆數量略微下降。隨后，他們還比較了三種不同的載體：插入片段比例（1：5、1：50和1：250）。他們發現，1：250的比例產生了最多的重組克隆。
他們應用這種克隆方法克隆了4個基因：gfp（1 kb）、gusA（1.9 kb）、lacZ（3.2 kb）和整個luxABCDE操縱子（6 kb）。他們利用限制性酶切分析和報告蛋白功能來驗證了所有重組質粒的正確結構。此方法的錯誤率低于3%，而與片段大小無關。不過，研究人員觀察到，隨著片段長度的增加，轉化后的克隆數量下降。曲線圖暗示插入片段的上限是6.7 kb。
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