CRISPR-Cas9新進展

日期：2017-02-23 08:54:02

因在CRISPR-Cas9基因編輯技術方面獲得重大突破而聲名鵲起的Jennifer Doudna雖然在CRISPR專利案中暫時失利（CRISPR專利最新消息：張鋒贏了)，但研究組成果不斷，繼去年年底開發了兩套新型的CRISPR-Cas基因編輯系統，命名為CRISPR-CasX 和CRISPR-CasY之后，最近又在小鼠大腦中完成了有效的基因組編輯，為CRISPR-Cas9在神經細胞疾病中的應用再添一把火。

這項最新研究公布在2月13日的Nature Biotechnology雜志上。

Cas9是一種由RNA導向的DNA結合和切割蛋白，能用于多種生物中，進行基因和非編碼遺傳元件的編輯修飾。目前Cas9介導的基因組編輯技術已經被應用到了眼、耳、肝和肌肉相關疾病的治療中，但是組織特異性傳遞不理想依然是一個問題，這主要是因為幾方面的原因，如直接整合到基因組DNA上，由細菌Cas9蛋白在編輯細胞中的持續表達引起的免疫應答和脫靶編輯。

一種解決方法就是利用非遺傳編碼，預組裝和短壽命的Cas9核糖核蛋白（RNP）復合物，在最新這篇文章中，研究人員為了檢測體內Cas9 RNP的活性，首先對Ai9 tdTomato小鼠進行了改進，這種報告小鼠模型能提供位點特異性基因組編輯的高通量和定量序列讀取，這種位點特異性基因組能令基因修飾細胞中的紅色熒光蛋白獲得功能信號。

研究人員研發出了一種單導向sgRNA，他們將其稱為 sgRNAtdTom ，sgRNAtdTom能去除終止盒，激活細胞中的tdTomato表達。之后他們利用這種sgRNAtdTom RNP復合物對神經祖細胞（NPC）進行核轉染后，通過顯微鏡和流式細胞術分析，研究人員觀察到了一種RNP劑量依賴性激活，同時基因位點的NGS序列分析也表明Cas9 RNP誘導出現了插入或者缺失突變。

這些一系列的研究發現表明盡管tdTomato+細胞的數目低于報道過的RNP總基因編輯數量，但是tdTomato小鼠可以用于肉眼檢測Cas9 RNP基因組編輯，并且可以在體內觀察到編輯細胞。

通過這項研究，Doudna等人證實了在成體小鼠海馬，紋狀體和皮層中注射Cas9核糖核蛋白（RNP）復合物，能完成小鼠大腦的有絲分裂后神經元的基因編輯，而且多個SV40核定位序列的Cas9編輯能將體內神經元編輯的效率提高十倍。

作者表示，這些研究成果證明了Cas9 RNP介導的神經祖細胞基因組編輯可以用于體外，以及體內多個不同的大腦區域，雖然目前還不清楚4×NLS-Cas9-2×NLS RNP體內親神經性（neurotropism）的具體機制，但是這可以用于神經元特異性靶向。由此說明這一技術未來可以用于治療不同神經元的遺傳神經系統疾病，糾正或滅活大腦神經系統疾病的潛在遺傳因素。此外，研究也表明功能性Cas9 RNP可以以以非遺傳編碼方式，有效，精確和安全的遞送到成體動物大腦的神經元上，解決了前文提出的問題，有助于未來利用Cas9-RNP復合物治療神經性疾病，以及用于一般的組織特異性基因編輯。

Doudna致力于探討了CRISPR-Cas9在各方面的應用，此前她也曾在Cell上發表綜述，指出CRISPR-Cas9在醫療領域有著廣闊的前景，可以用來矯正致病突變，治療人類疾病。研究者們也在嘗試用這一技術操縱生態群體，比如根據毒力或者抗性基因殺死相應的細菌、快速改變種群性狀、控制入侵物種、改良主要農作物等等。這一技術將帶領生物學研究進入一個新的時代。