北大魏文勝課題組：提高基因敲除效率的新方法

日期：2016-11-04 08:57:20

基因組編輯技術(shù)，可讓科學(xué)家們能夠在各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)基因敲除。然而，用一種典型的方法，以一種及時(shí)的方式，完全破壞一個(gè)靶基因，在技術(shù)上是具有挑戰(zhàn)性的。為了提高產(chǎn)生可靠基因組修飾的效率，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院魏文勝課題組，設(shè)計(jì)了一種方法，其使用一個(gè)線性供體片段，該片段包含一個(gè)報(bào)告系統(tǒng)。結(jié)合一種不依賴于同源重組（HR）的敲入策略，研究人員成功地富集了特異性攜帶靶基因突變的細(xì)胞克隆。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在11月1日的《FEBS Letter》雜志。

基因組編輯技術(shù)徹底改變了基因功能的實(shí)驗(yàn)性研究。三大主要技術(shù)：ZFN（鋅指核酸酶）、TALENs（轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶）和CRISPR / CAS系統(tǒng)，采用不同的機(jī)制來產(chǎn)生序列特異性雙鏈斷裂（DSB），隨后觸發(fā)本地修復(fù)系統(tǒng)來完成序列特異性的修飾。這些強(qiáng)大的技術(shù)在功能基因研究、染色體位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)和實(shí)時(shí)成像、疾病突變的糾正、基因療法中有著廣泛的應(yīng)用。

CRISPR / Cas系統(tǒng)由于其效率高、易操作，而變得尤為流行。然而，雖然CRISPR / Cas系統(tǒng)在基于設(shè)計(jì)和序列特異性的基因組研究中具有前所未有的力量，但它在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生基因敲除的簡單任務(wù)，在技術(shù)上仍然是有挑戰(zhàn)性的。

科學(xué)家們已經(jīng)作出了各種努力，來提高產(chǎn)生基因敲除的效率。然而，各種缺點(diǎn)限制了這些技術(shù)的一般和廣泛應(yīng)用，甚至敲除一個(gè)單一基因有時(shí)是一個(gè)漫長、繁瑣和高風(fēng)險(xiǎn)的過程。特別是，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生多基因敲除，仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。

如果靶基因中斷產(chǎn)生的表型變化，可用于富集，就很容易得到基因敲除的克隆，如HeLa CSPG4−/−細(xì)胞賦予艱難梭菌毒素B抗性。然而，這種策略不能普遍應(yīng)用。獲得基因敲除的傳統(tǒng)方法是把表達(dá)Cas9和sgRNA的質(zhì)粒，與表達(dá)耐藥性或熒光蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，但這個(gè)選擇不會(huì)增加突變率或富集包含靶修飾的那一小部分細(xì)胞。

先前已有研究報(bào)稱，如果一個(gè)同源等位基因被修改，靶等位基因的突變頻率一般是很高的。該研究小組認(rèn)為，如果我們可以在其中一個(gè)靶等位基因上的特定位點(diǎn)插入一段供體序列，并選擇表達(dá)供體遺傳標(biāo)記基因的克隆，我們就能夠富集這些罕見的事件，其中所有的等位基因是被修改的。已有研究表明，外源dsDNA片段可通過不同的修復(fù)機(jī)制，被整合到具有雙鏈斷裂（DSBs）的染色體位點(diǎn)中。比起通過同源重組修復(fù)（HR），通過NHEJ介導(dǎo)的DNA修復(fù)，一般具有更高的整合效率。為了確保供體序列的插入效率，并避免克隆長側(cè)翼序列克隆的麻煩，該研究小組使用CRISPR/Cas9引發(fā)的HR獨(dú)立性DNA修復(fù)，來介導(dǎo)外源線性供體DNAs的插入。

結(jié)合不依賴于同源重組（HR）的敲入策略，該研究小組成功地富集到那些特異性攜帶靶基因突變的細(xì)胞克隆。當(dāng)把這種特殊程序與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相結(jié)合使用，員在一步式程序中產(chǎn)生單個(gè)和多個(gè)基因敲除時(shí)，研究人員觀察到了大大提高的成功率。這種新的方法進(jìn)一步增強(qiáng)了基因及其功能的分子生物學(xué)研究。