中美科學家用CRISPR制備腎癌模型

日期：2016-07-07 09:27:33

轉移性腎細胞癌（mRCC）幾乎是無法治愈的，是RCC有關的高死亡率的主要原因。Von Hippel Lindau (VHL)是一個腫瘤抑制基因，在大多數的透明細胞RCC（ccRCC）病例中是缺失的。然而，它對于缺氧誘導因子-1α(HIF-1α) 和 -2α (HIF-2α)的調控發揮了什么作用，還沒有得到很好的研究。

6月30日，Nature子刊《Scientific Reports》在線刊登了加州大學洛杉磯分校、華中科技大學同濟醫學院的一項最新研究成果，題為“CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma”。這項研究的通訊作者是加州大學洛杉磯分校的華裔教授吳若萍（Lily Wu）。華中科技大學同濟醫學院的Hua Xu、Wei Guan等人是本文共同作者。

mRCC的治療方案是有限的，因為這種腫瘤對傳統化療和放療表現出耐藥性。治愈這種疾病的一種療法是白介素-2（IL-2）療法，但是只作用于大約7%的患者。最近發展起來的靶向療法——包括靶定免疫檢查點抑制劑程序性細胞死亡-1（PD-1）的療法，表現出一定的功效。但是，還缺乏持久的干預措施來對抗mRCC，從而迫切需要一種疾病模型，并深入了解這種疾病的驅動機制。

我們對于ccRCC的了解來自于對腫瘤抑制基因VHL的研究。遺傳性的VHL綜合征病例表現出ccRCC的發展風險升高。隨后的研究表明，這個基因在高達90%的散發性ccRCC病例中是沉默的。VHL通過識別和靶定缺氧誘導因子（HIF-1α, HIF-2α和HIF-3α）的α亞基用于泛素化和降解，而調控著缺氧反應。在低氧條件下，VHL不能識別HIF-αs，它們通過與HIF-1β結合來易位到細胞核中，并制定缺氧反應所必需的轉錄程序。

研究人員試圖通過敲除VHL，來制備ccRCC的小鼠模型。最近的研究表明，除了VHL之外，Bap1的缺失可有助于更一致地制備ccRCC小鼠模型。雖然其中一些研究顯示出早期囊性ccRCC變化和局部腫瘤的跡象，但是這些研究無法產生這種疾病的侵襲性、轉移性形式。為此，許多研究都依賴于RENCA模型，最廣泛使用的RCC免疫活性小鼠模型。盡管這種小鼠模型的效用已經得以證明，但是科學家們最擔心的問題是，其在野生型VHL表達中的臨床適用性。

以前的研究表明，VHL缺失可促進一種更具侵襲性和轉移性的腫瘤模型。有大量研究表明，靶定VHL功能可能導致一小部分的上皮間質轉化（EMT）。這個過程已被確定為一個中心節點，腫瘤通過這個過程從它們的原發部位轉移到身體其他部位。EMT涉及到細胞間接觸的減少，以及從上皮細胞基底膜上脫離，轉化為一種更為移動性和侵襲性的細胞類型。這些表型變化的同時，是各種各種的分子變化，包括上皮標記的缺失，例如在臨床ccRCC標本中常見的E鈣粘素，還有一些間葉細胞標記的獲得，例如N鈣黏著蛋白和α-SMA。值得注意的是，許多研究證明了HIF-1α對于推動這些變化的作用。此外，HIF-1α已被證明可在其他腫瘤轉移模型中導致轉移。這些結果表明，在RENCA 模型中刪除VHL，可能會產生一種更具轉移性的臨床相關模型。

CRISPR基因操縱方法最近已被用于常規實驗室研究。這一突破性的基因敲除技術，因為易用性和完全敲除基因功能的有效性而著名。基于釀膿鏈球菌適應性免疫系統，這種以RNA為基礎的基因組編輯技術，已迅速在許多生物研究中證實了其效用。研究人員開發出CRISPR方法，是為了生成基因敲除小鼠，在細胞系中進行全基因組篩查，在小鼠體內敲除基因，并在體內篩查轉移性的基因。然而，迄今為止，很少有研究證明CRISPR介導的小鼠細胞系修改，來生成改進的可移植小鼠腫瘤模型。

在這項研究中，研究人員利用CRISPR基因組編輯工具，敲除RENCA細胞中的VHL表達。他們發現，在RENCA模型中，CRISPR / Cas9介導的VHL敲除，可導致指示EMT的形態學和分子改變，進而驅動到肺部的轉移增加。HIF-1α缺陷型的RENCA細胞，在VHL敲除后不能發生EMT。

RNA-seq顯示，幾個HIF-1α調控的基因，在VHL基因敲除的細胞中是上調的，它們的過度表達意味著，癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中一種更具侵襲性的ccRCC。在一個新的臨床數據集中的獨立驗證證實，相對于鄰近的正常組織，這些基因在ccRCC樣本中是上調的。這些結果表明，VHL的缺失可能通過穩定RCC中的HIF-1α而驅動腫瘤細胞的傳播。更好的理解這個現象背后的機制，可以指導科學家們尋找更有效的療法對抗mRCC。

科學家們對腎癌這種疾病進行了深入的研究。2014年8月，貝勒醫學院帶領的一個國際科學合作項目，發現了可能導致腎嫌色細胞癌的遺傳學改變的線索，不僅為這種罕見癌癥，也為其他類型癌癥，提供了新的見解。相關研究結果發表在2014年8月21日的國際著名期刊《Cancer Cell》。相關閱讀：測序揭示罕見腎癌的獨特遺傳變化。

2015年12月，Cell雜志的“SnapShot: Renal Cell Carcinoma”這篇文章總結了目前關于這種癌癥基因全景圖中的幾個關鍵特征，主要途徑，腫瘤演變和異質性等多方面內容，并且也介紹了腎細胞癌的相關治療進展。

今年3月份，貝勒醫學院的一個研究團隊深入分析了近900個腎癌樣本。過去人們根據腎癌細胞在顯微鏡下的特征將腎癌分為三個大類。而這項研究表明，在分子水平上腎癌還可以進一步分為九個亞類。這些腎癌亞類各具特征，受到影響的分子通路和患者的生存情況也大相徑庭。