科學家揭示細胞焦亡分子機理

日期：2016-06-21 08:54:17

6月9日，國家蛋白質科學研究（上海）設施五線六站用戶北京生命科學研究所研究員邵峰及其合作者中國科學院生物物理研究所王大成組在《自然》（Nature）雜志在線發表題為Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family 的長文（article），揭示了GSDMD蛋白以及其它gasdermin家族蛋白介導細胞焦亡和在天然免疫中發揮功能的分子機理。

細胞焦亡或炎性壞死是一種程序性細胞壞死，表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內容物的釋放進而激活強烈的炎癥反應。細胞焦亡是機體重要天然免疫反應，在拮抗感染和內源危險信號中發揮重要作用。過度的細胞焦亡會誘發包括敗血癥在內的多種炎癥和免疫性疾病。傳統研究認為，細胞焦亡由包括caspase-1和caspase-4/5/11在內的炎性caspase活化而誘發。Caspase-1在病原信號誘導形成的炎癥小體復合物作用下被激活；實驗室此前的工作表明caspase-4/5/11是細菌脂多糖（LPS，又稱內毒素）的胞內受體，在結合LPS后發生寡聚而活化，是革蘭氏陰性菌誘導敗血癥的關鍵因素（Shi et al., Nature 2014）。然而，20多年來人們對于炎性caspase如何誘導細胞焦亡的機理一直完全不清楚。在去年的一項突破性進展中，實驗人員找到了一個所有炎性caspase的共同底物蛋白GSDMD，炎性caspase通過切割GSDMD釋放其N端結構域而引發細胞焦亡（Shi et al., Nature 2015）。GSDMD屬于一個被稱為gasdermin的功能未知的蛋白家族，該家族還包括GSDMA，GSDMB，GSDMC，DFNA5，DFNB59等。人的DFNA5和小鼠Gsdma3的遺傳突變分別導致非綜合征性耳聾和小鼠脫毛以及皮膚發炎等疾病，GSDMB基因的多態性和兒童哮喘的發生密切相關。該研究也發現GSDMA3蛋白雖然不是炎性caspase的底物，但其N端結構域也能誘導細胞焦亡，并且，導致小鼠脫毛的突變體GSDMA3蛋白都喪失了分子內自抑制作用進而顯示出持續誘導細胞焦亡的活性。然而，炎性caspase切割GSDMD如何引發細胞焦亡及其它gasdermin家族蛋白在細胞焦亡相關天然免疫中如何發揮功能的機制則仍然不清楚，這也是天然免疫研究的前沿熱點問題。

在這項新的研究中，研究人員首先發現幾乎所有的gasdermin家族蛋白的N端結構域都具有誘導細胞焦亡的功能，而除GSDMD外，其它家族成員并不是炎性caspase的底物，這個發現重新定義了細胞焦亡概念，開辟了一個新的程序性細胞壞死的研究領域。有意思的是，gasdermin家族的N端結構域在細菌中也顯示出明顯的致死毒性。這一現象暗示gasdermin N端結構域可能是通過直接破壞細胞膜而產生殺死細胞。為了驗證這一假設，他們制備了活化形式的GSDMD，GSDMA 和 GSDMA3蛋白，在體外脂質體共沉淀的實驗中，這三種gasdermin蛋白的N端結構域均能夠特異地結合磷酸化磷脂酰肌醇（phosphoinositide）或心磷脂（cardiolipin），而4, 5-二磷酸磷脂酰肌醇和心磷脂分別是真核細胞和原核細胞膜上特有的磷脂，這和gasdermin N端結構域在真核細胞和細菌中均展示出細胞毒性完全吻合。通過生物化學和熒光顯微成像的細胞實驗，研究人員進一步證實，在真核細胞焦亡過程中，活化的gasdermin N端結構域會從細胞質中轉移到細胞膜上，細胞隨后出現體積膨脹和細胞膜向胞外吐泡的現象。此外，活化的gasdermin N端結構域重組蛋白只能從真核細胞內部破壞細胞膜，而直接加入到細胞培養上清中的蛋白則不能裂解細胞，這也和磷酸化磷脂酰肌醇只分布在細胞膜內側完全吻合。

利用脂質體泄漏實驗，研究團隊進一步發現gasdermin N端結構域能夠高效特異地破壞含有4, 5-二磷酸磷脂酰肌醇或心磷脂的脂質體，導致其發生嚴重泄漏，利用不同尺寸葡聚糖分子，他們發現破壞后的脂質體只能允許小于10納米尺度的分子被釋放，該現象提示gasdermin N端結構域有可能在脂膜上聚合形成規則的孔道。生化交聯實驗結果證實gasdermin N端結構域在結合脂質體或是在細胞焦亡中轉位上膜后都會發生高度聚合。利用負染電鏡的方法，他們首次觀察到gasdermin N端結構域能在特異磷脂或天然磷脂組成的膜上打孔，形成很多蜂窩狀的孔道，這些孔道的內徑約10-14 納米。進一步的電鏡分析揭示這些分子孔道具有16重對稱性，表明gasdermin N端結構域在膜上形成16元聚合體的孔道。此外，他們還通過對GSDMA3蛋白高分辨率晶體結構的解析，揭示了gasdermin N端結構域作為一種全新的打孔蛋白的獨特結構特征，以及與C端結構域之間的精細的自抑制相互作用?；诮Y構設計的點突變實驗結果進一步確認了gasdermin N端結構域結合膜脂和在膜上打孔的特性是其誘導細胞焦亡的分子基礎。

該研究證明了GSDMD是炎性caspase誘導細胞焦亡的直接執行者，首次揭示了gasdermin 家族蛋白的N端結構域具有在膜上打孔進而破壞細胞膜的功能，這不僅清晰闡明了炎性caspase通過GSDMD誘導細胞焦亡的分子基礎，也將細胞焦亡的概念重新定義為由gasdermin介導的細胞程序性壞死。研究結果不僅為針對GSDMD開發自身炎癥性疾病和敗血癥的藥物奠定了堅實的理論基礎，也為后續研究其它gasdermin蛋白在程序性細胞壞死和天然免疫中可能的生理功能開辟了道路。