Traver Hart：利用CRISPR發(fā)現(xiàn)未知基因功能

日期：2016-06-13 08:49:49

自2012年底CRISPR/Cas9最初被用于基因編輯之后，這個前途光明的技術已經(jīng)被應用到了許多研究領域，而且隨著技術的改良，越來越多的研究團隊利用CRISPR進行大規(guī)模的遺傳篩選，比如用于識別導致癌癥抵抗治療的突變，或者加速藥物靶標評估。RNA干擾，相比于CRISPR/Cas9 在遺傳篩選方面的作用，無論是效率和特異性方面，目前都難以望其項背了。

人類細胞系遺傳篩選尋找癌癥靶向

以RNA干擾為基礎的遺傳篩選已經(jīng)實現(xiàn)了人類細胞全基因組范圍篩選，但是由于對 RNAi 生物學的不完整解析，以及由此產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，導致了一些錯誤的分析，比如一篇2012年發(fā)表在Science雜志上的文章：Use and Abuse of RNAi to Study Mammalian Gene Function 就指出了這些問題，并認為研究哺乳動物基因功能需要更加精確復雜的方法。

2013年，Science接連發(fā)表了兩篇人類細胞CRISPR-Cas9敲除篩選研究成果，一篇發(fā)現(xiàn)靶向18,080個基因（64,751個獨特靶向序列）的全基因組范圍CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文庫慢病毒傳遞，能進行在人類細胞中的正向和負向選擇性篩選；另外一篇通過CRISPR技術，鑒定出允許黑色素瘤細胞增殖的基因和讓它們對某些化療藥物產(chǎn)生耐受性的基因。

RNAi 的不足之處在于它靶向 mRNA 而不是 DNA，因此它不可能100% 剔除基因。張鋒之前曾表示，“CRISPR 能夠完全地剔除細胞中的一種給定蛋白，而shRNA(短發(fā)夾RNA) 只是降低它的表達水平，但是從不會達到完全剔除。”

來自加拿大多倫多大學Jason Moffat實驗室的Traver Hart也是一位CRISPR技術領域的青年科學家，他曾自己定義了一套用于評估RNAi和CRISPR遺傳篩選治療的金標準，并且利用HCT116細胞系（來自人類結腸癌），Hart發(fā)現(xiàn)CRISPR篩選不僅更加敏感，也能避免出現(xiàn)額外的背景錯誤。

相比于RNAi篩選，CRISPR篩選具有哪些優(yōu)勢呢？CRISPR 篩選是通過“整個生物學意義基因表達（水平）進行篩選，而shRNA似乎只能在非常高水平表達的基因中進行篩選，”Hart說，“這些信息我們無法從shRNA數(shù)據(jù)中獲取，除非我們能更好比對它，所以我們無法得知那些不知道的信息，而CRISPR技術，我們確信它將會革新遺傳篩選領域。”

Hart研究組去年發(fā)表文章，逐個關閉了近1.8萬個基因（整個人類基因組的90%）來尋找對細胞生存至關重要的基因。由此Hart生成了多倫多敲除文庫（Toronto KnockOut (TKO) library），靶向17,661個人類蛋白編碼基因的慢病毒編碼導向RNAs二代文庫。Hart說，“這個數(shù)字對于任何進行shRNA或者RNAi研究的人來說都十分驚人（后者一般只能獲取幾百個數(shù)據(jù)）”。

12年前的人類基因組測序讓科學家們編寫出了構成我們細胞和身體的部件——我們2萬個基因的清單。盡管取得了這一重大的成果，我們?nèi)匀徊磺宄總€基因的功能，或當一些基因出錯時讓我們生病的機制。為了做到這一點，科學家們意識到必須要逐個去關閉整個基因組中的基因，以確定細胞中哪些過程出現(xiàn)了錯誤。但可以利用的工具不是不準確就是太慢。

CRISPR的出現(xiàn)使得快速及高精度關閉基因變?yōu)榭赡埽疫@項研究也通過在5種不同的癌細胞系，包括腦癌、視網(wǎng)膜癌、卵巢癌和2種大腸癌細胞中關閉一些基因，發(fā)現(xiàn)了每種腫瘤都依賴于一組獨特的基因，可以用一些特異性藥物來靶向它們。這一研究發(fā)現(xiàn)為設計出只靶向癌細胞，而不損傷周圍健康組織的新療法帶來了希望。