CRISPR領銜科學家探討CRISPR遺傳篩選
日期：2016-06-07 08:49:09
基因編輯，尤其是CRISPR/Cas9系統，從某種意義上來說就像是一輛正在生產的閃亮新車，在構建主要框架的同時也開始啟動，而且還準備開始一路飚車。
自2012年底CRISPR/Cas9最初被用于基因編輯之后，這個前途光明的技術已經被應用到了許多研究領域，而且隨著技術的改良，越來越多的研究團隊利用CRISPR進行大規模的遺傳篩選，比如用于識別導致癌癥抵抗治療的突變，或者加速藥物靶標評估。RNA干擾，相比于CRISPR/Cas9 在遺傳篩選方面的作用，無論是效率和特異性方面，目前都難以望其項背了。
同時，譬如MD安德森癌癥中心等處的研究人員也開始進一步了解CRISPR/Cas9的特性和局限性，了解它到底能做些什么，比如分析人類細胞系。CRISPR/Cas9 工具箱不斷的擴大，Broad研究院的張鋒等人也開始利用Cas9結合到基因組上，停止或者加強轉錄。他們對于CRISPR/Cas9在遺傳篩選方面的作用，有何看法呢？
張鋒研究組曾在“Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity”這篇文章中，探討了從化膿性鏈球菌中改變了組成Cas9酶的1400個氨基酸中的3個氨基酸，從而將基因編輯中脫靶效應降低到了幾乎無法檢測的水平的可能性。當RNA 與DNA 不是那么配對的時候，Cas9內切酶會誘導脫靶突變，導致這無法成為臨床試驗中的精確基因編輯。
為了能容納下Cas9蛋白，DNA鏈需要分開，張鋒研究組進行了結構分析，發現在Cas9蛋白位點的負電荷非靶標DNA上有一個合適的正電荷凹槽。“我們認為如果能中和部分正電荷，就能消弱穩定性，從而能Cas9更具特異性，”張鋒說。
他們利用已知定位在特殊脫靶位點上的導向RNAs來進行了這個方法的實驗，研究組構建出了Cas9的32個單突變，然后將每個突變通過EMX1基因有效，但容易出現錯誤的導向RNA，靶向EMX1。
結果發現其中五個能完成EMX1基因的基因編輯，但是會十倍比率的減少脫靶位點的切割，之后研究人員又嘗試利用Cas9突變去切斷另外一個基因：VEGFA，這種基因已知能在兩個之前識別的脫靶位點上進行切割。雖然所有的Cas9突變都減少了脫靶效應，但是研究人員認為他們應該結合這些突變，讓Cas9更加特異性。因此他們利用三點突變體（triple-point mutations）產生了兩個不同的突變，發現“我們能完成靶向激活，并進一步減少脫靶活性，”張鋒說。
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