血液中的寶藏：外泌體microRNA

日期：2016-04-18 09:12:19

血液是唯一與所有器官都有接觸的組織，攜帶著有關機體的大量寶貴信息。在理論上，檢測血液攜帶的 DNA、RNA、囊泡和細胞殘骸可以幫助人們診斷和監控各種疾病。產前基因篩查是血液檢測的一個重要應用，不過其他循環生物學指標正在受到越來越多地關注，比如甲基化、RNA、微囊泡和外泌體。為了幫助大家更好的分析甲基化、分離囊泡、提取RNA、存儲樣本和分析數據，The Scientist雜志最近與多位專家學者探討了檢測不同血液生物學指標的策略，貢獻出了相應的注意事項和實驗技巧。

研究者：Illinois大學副教授Neil Smalheiser

研究項目：從血漿外泌體鑒定阿爾茨海默癥的miRNA指標

研究背景：外泌體與其他囊泡的區別主要在于尺寸、浮力密度、形成機制和特定細胞內指標。MicroRNA（miRNA）是長約22nt的非編碼RNA，這些小RNA在天然細胞中大量存在，它們能與靶基因的mRNA配對，在轉錄后水平上調控目標基因的表達。大量研究表明，microRNA控制著胚胎發育、細胞分化、器官生成等重要的生物學過程，對于正常發育、細胞生長和生物行為非常關鍵，而且與復雜的神經退行性疾病有關。近來不少研究者發現，阿爾茨海默癥患者的大腦組織和血液都存在miRNA水平的改變。

檢測miRNA: Smalheiser團隊使用了分離外泌體的傳統方法——差速離心（differential ultracentrifugation）。他們用這種方法逐漸洗掉游離RNA、蛋白聚合物和細胞殘骸，只留下外泌體。隨后研究人員從外泌體提取RNA并對其進行測序，建立了成熟miRNA的數據集。他們通過計算模型鑒定了一組可以將阿爾茨海默癥和對照準確分開的miRNA。

不過，超速離心速度較慢，也無法實現高通量。此外，超速離心中有許多變量需要標準化（例如轉子的選擇和離心條件等等），很難轉化到臨床中去。好在，市場上出現了多款方便的試劑盒。比如，賽默飛世爾科技推出了幾款總外泌體提取試劑盒（Total Exosome Isolation Reagent），能夠分別從細胞培養基、血清、血漿、尿液及其他體液中分離出完整的外泌體。

實驗技巧：研究人員使用的離心方法使他們能夠獲得相對純凈的外泌體，Smalheiser指出。在用Trizol試劑提取RNA的時候，他的團隊發現添加糖原使產量提升了將近23%，這一步驟可以用于其它低產量RNA。

在實驗室中，RNA提取過程的痛苦是眾所周知的。RNA極其脆弱，對RNAses酶的降解非常敏感，而這種酶幾乎無處不在。美國佛羅里達大學的研究人員為此開發了一種新的RNA提取方法，并將其發布在《Applications in Plant Sciences》上。他們將Trizol試劑、Turbo DNA試劑盒（由Life Technologies Ambion生產）和自己開發的步驟結合起來，讓RNA提取變得更迅速、更有效、更可靠。