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華裔學者開發新型CLIP技術

日期:2016-04-18 09:11:29

 有數以百計的蛋白質可以與RNA結合,但是弄清有哪些蛋白在哪里結合RNA,以及它們相互作用之后發生了什么,一直都是一個挑戰。

 

除了轉錄調控之外,還有更多的基因調控。隨著研究人員越來越意識到RNA所扮演的不同角色,尋找這些核酸和RNA結合蛋白(RBPs)之間的相互作用,就顯示出更大的重要性。數以百計的RBPs是已知的——其中很多涉及各種疾病,如神經退行性變、自身免疫缺陷和癌癥,但是大部分仍有待于發現。發現RBPs結合的序列,可以闡明它們調控RNA轉運、處理以及翻譯的機制。

 

發現RBPs結合位置的最先進的方法,依賴于核糖核蛋白復合物的交聯和免疫沉淀反應(CLIP),然后進行測序。這些程序在技術上具有挑戰性,需要放射性,實驗的失敗率很高,并會產生高百分比的重復讀取。加州大學圣地亞哥分校的Eric Van NostrandGene W Yeo在一封電子郵件中說道:“當執行大規模CLIP實驗作為ENCODE聯盟的一部分時,我們認為,當前方法沒有足夠的能力分析數以百計的因素。”他們及其同事創建了加強型的CLIP (eCLIP),來解決這些問題。Gene W Yeo(姚偉明,音譯)是加州大學圣地亞哥分校華裔學者,其負責的科學實驗室主要研究RNA在調節人體正常及腫瘤干細胞生物學和神經分化方面的影響,包括計算生物基因組、建立RNA、干細胞生物學及疾病模型。

 

eCLIPChIP-seq借鑒了它的兩步多路復用庫制備技術。首先,研究人員將一個有索引的3’適配子(可允許隨后的匯集),與附著于免疫沉淀反應珠子上的RNA片段連接起來。然后,他們通過電泳和消化掉蛋白質,分離了復合物。在反轉錄RNA后,他們在PCR擴增之前,將另一個包含內聯隨機5-10-mer3 適配子,連接到現在的單鏈DNA上。

 

逆轉錄往往會在交聯部位終止,這可讓研究人員獲得核苷酸分辨率。在相同的順序讀取的情況中,隨機單鏈DNA適配子序列,將能夠區分來自PCR副本的獨特片段,讓后者被丟棄,從而使映射讀取的數量更為定量,并減少了浪費的測序。此外,eCLIP為非特異性背景和固有偏誤,添加了一個大小匹配的免疫沉淀反應前對照。

 

這些修改意味著,為了獲得更高比例的可用讀數并產生具有足夠復雜性的文庫,eCLIP需要的擴增比其他方法少大約1000倍,以識別更混雜的RBPs所使用的序列。現在,我們可以使用這些序列,來弄清RBPs如何完成它們的作用。

 


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