中國農科院Nature子刊CRISPR新成果

日期：2016-04-06 09:28:36

精確的DNA/基因替換，是一種很有前景的基因組編輯工具，很容易推廣到分子工程和設計育種。目前，CRISPR/Cas9系統能夠很好地作為一種工具用于植物基因敲除，例如：中國農科院用CRISPR實現大豆基因組編輯；安徽農科院用CRISPR編輯水稻基因；基因組編輯技術在植物基因功能鑒定及作物育種中的應用。然而，植物中的基因替換卻很少有報道。

4月1日，Nature旗下子刊《Scientific Reports》在線發表了中國農科院作物科學研究所與安徽農業大學的一項研究成果，題為“An alternative strategy for targeted gene replacement in plants using a dual-sgRNA/Cas9 design”。在這項研究中，研究人員在穩定轉化的植物中，成功地制備了一種基因/替換系統，可將感興趣的基因用于目標作物的遺傳改良。本文通訊作者是中國農科院作物科學研究所的謝傳曉博士，作物科學研究所的徐云碧研究員、毛龍研究員也是本文共同作者。

用于精確的靶向基因組編輯的簡單方法，可能在植物的基因功能鑒定和遺傳改良方面有著重要的應用價值。近年來，大范圍核酸酶1、鋅指核酸酶(ZFNs)和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)，已被開發作為序列特異性核酸酶，用于將靶向雙鏈斷裂（DSBs）導入DNA，以讓我們通過內源性的DNA損傷修復途徑，進行基因編輯。

最近，有研究人員基于CRISPR相關核酸酶系統，開發出一種新的RNA引導性基因編輯工具。CRISPR/Cas9核酸酶系統，可以用一個嵌合RNA（一個所謂的單導向RNA，sgRNA）靶定特定的基因組位點，與蛋白質引導的靶向工具相比，具有更高程度的靶向選擇靈活性。CRISPR/Cas9系統已被證實能促進不同物種的基因組編輯，包括哺乳動物(包括人類)、微生物和植物。

使用CRISPR/Cas9實現的基因敲除，代表著這個系統的最早應用，因為由Cas9誘導的DSBs，可通過一種非同源末端連接(NHEJ)機制而得以修復，這是一種容易出錯的修復途徑，可能會在DNA修復過程中引入短的缺失或插入。HDR(homology-directed修復)，是修復染色體中DSBs的一種替換方法，對于植物基因組工程更有吸引力，因為它可以實現更微妙的DNA序列修改，包括DNA修正、靶向基因敲入或更換，或任何類型的突變。

HDR依賴性靶基因置換或敲入，為基因組編輯提供了一個前所未有的機遇，但也更有挑戰性，因為靶向DSB(s) 必須和一個修復模板共存。可以通過使用一對TALENs或sgRNAs與Cas9核酸酶，產生靶向的基因組缺失突變。誘導的雙重DSB損傷或缺失突變，也是靶向基因替換的一個必備步驟。

據報道，在一種體外系統中，CRISPR/Cas9可在煙草(N . benthamiana)原生質體中成功實現HDR介導的基因替換。也有研究在玉米中利用CRISPR/Cas9，通過HDR，將一個特征基因插入到一個靶向的DSB損傷部位，并用Cas9和sgRNA表達組件共同“轟擊”DNA供體修復模板，以確保有足夠的供體拷貝出現在靶細胞中。粒子轟擊策略的優點在于，可以提供許多供體模板的副本。然而，應該在后續步驟中處理目標生物中的轉換拷貝，來自載體的一部分DNA序列，可能是接收者基因組的污染物。

CRISPR/Cas9的穩定變換，和一個包含基因組編輯必要元素的載體（通過農桿菌介導的轉化），可以通過識別“非轉基因”生物很容易地篩選出來。關于HDR介導的基因打靶，Fauser等人證明，核酸酶和切口酶系統都是有效的工具。當配對部位互相靠近時，精確設計相鄰配對的sgRNA/Cas9切口酶——這可能有增強特異性的優點，可被用于靶定基因插入、基因堆疊和基因敲入。然而，迄今為止，還沒有研究在植物中創建體內靶向基因替換事件，同時具有較低的轉基因污染風險。

在這項研究中，研究人員通過一對sgRNAs的同時傳遞，來靶定兩個MIRs（AtMIR169a和AtMIR827a）的兩個側翼區。他們首先設計了一個雙重sgRNA/Cas9載體組合(construct# 1)，成功地刪除了miRNA基因區域——MIR169a和MIR827a。通過PCR和隨后的測序，研究人員驗證了這些缺失，從而在MIR169a和MIR827a位點分別產生了20%和24%的刪除效率。