Nature子刊：液體活檢技術的新進步
日期：2016-03-30 10:22:31
循環腫瘤DNA（ctDNA）的高通量測序有望實現個性化的癌癥治療。不過，血液中的游離DNA（cfDNA）有限，限制了分析靈敏度。為此，斯坦福大學的研究人員近日開發出一種錯誤校正方法，能夠檢測到頻率低至0.004％的突變等位基因。
在周一發表的《Nature Biotechnology》上，研究人員介紹了這種稱為集成數字錯誤抑制（IDES）的方法。它是基于斯坦福團隊之前開發的一種ctDNA檢測技術，名為CAPP-seq，目前已被羅氏收購。
之前，CAPP-seq技術的檢測極限是0.02%，不過許多測序片段都有錯誤。為了解決這些錯誤，研究團隊首先設計了一種分子條形碼策略。許多ctDNA檢測開發者也采用這種方案來降低錯誤率。單鏈DNA和雙鏈DNA條形碼策略都存在，不過都有缺點。雙鏈DNA條形碼在降低錯誤上更佳，但效率不及單鏈DNA條形碼，因此不適合ctDNA量有限的樣本。
為此，他們著手設計出一種混合策略。首先，他們設計出測序接頭，可用于單鏈和雙鏈的分子條形碼。雙鏈分子的每條鏈上首先標記一個四堿基條形碼，稱為索引條形碼。接著，他們在兩條鏈的每個接頭上添加兩個二堿基條形碼，稱為插入條形碼。在測序之后，互補的插入條形碼可匹配，重新構建出原始的雙鏈DNA分子。
第二步，斯坦福的團隊設計了一種計算工具，可以校正測序或PCR的系統錯誤。為了實現這一點，他們首先對12名健康成人的樣本開展CAPP-seq檢測。研究人員報告稱，盡管所有種類的SNV都有背景錯誤，但最常見的是G→T的顛換，而C→T和G→A的錯誤也有。
他們發現，G→T錯誤的出現是因為雜交捕獲過程中的氧化損傷。他們利用一種計算方法來抑制這些錯誤。這兩種策略的結合，使得錯誤率下降了15倍，這是通過30個健康對照樣本和142個非小細胞肺癌樣本證實的。
研究人員也在NSCLS樣本上驗證了此檢測。首先，他們檢測了41名晚期NSCLS患者的EGFR熱點突變。他們在88個血漿樣本中檢測到412個EGFR變異，所有變異都已經通過腫瘤活檢樣本確認。此外，這項檢測未檢出任何假陽性。
接著，他們在參考細胞系上評估了檢測的技術限制。他們創建了參考細胞系混合物，其中變異的等位基因的頻率在0.05-1.6%。他們發現，條形碼策略和計算校正方法是互補的，結合使用效果更佳。這種方法的理論檢測極限是0.00025%。
最后，他們利用這種方法來監控30名NSCLC患者中的突變，這些患者的腫瘤已經過基因分型。研究人員發現，他們能夠檢測到頻率低至0.004%的突變。“據我們所知，這是到目前為止深度測序檢測到的最少量ctDNA，”作者寫道。
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