簡化人類細胞基因編輯的新方法

日期：2016-01-20 09:16:50

用RNA指導的CRISPR-Cas9系統的動物和植物基因組工程，正在改變著生物學。與其他基因工程工具相比，這種技術更容易使用，并且更有效，因此，在其發現后的短短幾年內，就已經被廣泛應用于世界各地的實驗室，也成為編輯人類多能干細胞、人類胚胎干細胞基因組最常用的技術。1月6日，Cell子刊《Cell Stem Cell》在線發表了來自哈佛大學和麻省總醫院研究人員的一篇綜述文章。在這篇文章中，研究人員簡單回顧了定制設計的核酸酶在hPSCs基因編輯中的應用，集中關注TALENs和CRISPR/Cas9的實際應用。突出了每種方法的優缺點，并討論了實驗設計的理論和技術方面的考慮。

1月12日，來自美國威斯康星大學麥迪遜分校的研究人員，在Cell子刊《Stem Cell Reports》發表題為“High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells”的研究成果，該研究提出了一個新的平臺——ArrayEdit，可對CRISPR-Cas9基因編輯的人胚胎干細胞進行高內涵分析。

CRISPR-Cas9這種新興的基因組編輯工具，利用一種設計的核糖核蛋白復合物，由兩個主要成分組成：（1）一個蛋白質，Cas9；和（2）一個引導性RNA（sgRNA）。同時，這種Cas9-sgRNA可切割基因組中的一段特定靶序列。CRISPR-Cas9編輯的人體細胞和組織，是藥物靶標識別、管理科學、醫學和基礎生物學的重要資源。

然而，人類基因編輯實驗通常需要為每個sgRNA進行費力的表達質粒克隆，在這些培養系統中，只有有限的機會觀察和干擾起作用的基因組編輯，因為在DNA切割事件期間和之后不久，我們很難分離和影像活體的突變細胞。因此，有必要提高現有的體外人類細胞培養系統的通量和能力，在這些系統中，可以用人類細胞和組織評估新的基因組編輯方法。特別是用人類多能干細胞的先進功能，可能最終擴大人類的臨床前模型系統，從患者特異性的細胞系，到從干細胞建立的復雜人類胚胎組織。

目前的基因組編輯技術，可產生異質性的人類細胞群，需要顯著的后續表征。在繼續其他研究之前，通過測序分析編輯細胞的基因組，是至關重要的，在測序分析過程中的幾個流程，需要破壞突變的細胞群。例如，選擇和新一代測序后的靶向基因破壞，可以鑒定藥物靶標，DNA需要一個獨立的、隨后的基因編輯實驗，來獲得活的的突變細胞用于下游分析，這個過程對于緩慢分裂或原代細胞來說，往往是不可行的。這會降低適當編輯細胞的表觀基因組和功能性特征。

目前，編輯的細胞內是否有持續的表觀基因組和功能性問題，尚不明確。也需要在單克隆水平進行進一步的序列水平表征，因為有頻繁和可變的中斷，或供體基因插入到編輯細胞系中的非靶向等位基因中。最后，精確分離編輯細胞的效率，對現有方法來說仍然是一個挑戰，通常只有20%或更低的效率，使人類基因組中產生近精確的缺失。

在這項研究中，研究人員描述了一個平臺，稱為ArrayEdit，將兩種能力結合起來：一步法轉錄；將微觸點印刷板和高內涵分析（HCA）相結合。首先，研究人員描述了一種方法，采用化學合成的寡核苷酸（以一種多孔道的方式有序排列），可以在幾個小時并行產生許多sgRNAs。

一步法轉錄sgRNAs不用純化就能傳遞，當與Cas9一起傳遞時，可以在人類胚胎干細胞（hESCs）中有效地產生所需的基因編輯。其次，研究人員描述了一種通用的培養和成像組合，通過對分布在編輯細胞集群的幾千個空間定義特征進行非破壞性的分析，來選擇編輯的細胞和組織。

研究人員能夠在2周時間內，分離出基因編輯的胚胎干細胞系，其中82%是他們所期望的突變，位于概念證明位點（LAMA5），而沒有任何可檢測到的脫靶突變。該平臺增加了重要的功能，可以讓我們輕松地觀察到人類細胞產生的復雜結構內的編輯和選擇。

近期，相繼有研究報道關于CRISPR-Cas9基因編輯技術的改進，例如，來自美國國立衛生研究院和瑞典烏普薩拉大學的研究人員，在國際著名學術期刊《Nucleic Acids Research》上發表的一項研究中，首次提出了一個已在斑馬魚中經過實驗驗證的CRISPR/Cas9靶序列數據庫（首個CRISPR/Cas9靶序列數據庫）。另外，來自中國科學院上海植物逆境生物學研究中心、昆士蘭大學的研究人員報告稱，他們構建出了一個新型的多路復用CRISPR/Cas9平臺，可用于在擬南芥中快速及有效地編輯多個基因。這一重要的研究成果發布在12月的《Plant Cell Reports》雜志上。我們有理由相信，隨著科學家們進一步的努力，這種熱門的CRISPR-Cas9基因編輯技術會更加趨向于完善。