基于PCR評估sgRNA特異性的方法

日期：2015-08-12 09:01:25

CRISPR/Cas9已經成為一種通用的基因組工程工具，依賴于一個單導向RNA（sgRNA）和Cas9酶進行基因組編輯。研究人員可以用簡單、快速和經濟的方法來產生sgRNAs，因此能夠在培養細胞、小鼠、斑馬魚和其他模型系統中進行靶向誘變。為了靶向效率，預先篩選sgRNAs，對于成功誘變和減少動物飼養成本，都是可取的。八月七日在國際學術期刊《Nucleic Acids Research》發表的一項研究中，來自美國國立衛生研究院的研究人員，提出了一種簡單、快速和具有成本效益的熒光PCR為基礎的方法——CRISPR Somatic Tissue Activity Test (CRISPR-STAT)，來確定sgRNA的靶向特異性效率。

最近，利用鋅指核酸酶（ZFNs）、TAL效應物核酸酶（TALENs）和CRISPRs進行基因組編輯所取得的進展，已經使人們有可能在許多系統（包括斑馬魚）中進行靶向誘變。而靶向特異性的ZFNs和TALENs組裝，由于設計、成本的限制和/或繁瑣的程序，具有很多局限性，CRISPR/Cas9需要設計一個引導RNA（sgRNA），可以很低的成本快速地合成。

此外，CRISPR/Cas9的靶序列是靈活的，僅僅受到一個protospacer相鄰基序（PAM位點）的需要的限制。因此，快速設計和生成多個靶標的sgRNAs是簡單的。然而，所有的sgRNAs在產生靶位點突變的時候，并沒有表現出類似的活性水平。通過計算方法預測活性，對于所有應用程序可能是不可靠的，因為標準是來自于有限的、背景特定的數據。因此，對任何給定sgRNA活性水平進行快速的實驗驗證，是必不可少的。

目前，已經開發了許多方法來評估靶向核酸酶（包括CRISPR/Cas9）的活性。確定體細胞活性水平的“金標準”方法，是通過對靶區域進行PCR，然后對大量克隆進行測序。雖然這種方法在確定活性水平方面，具有很高的靈敏度和特異性，但是它是昂貴的，并且是勞動密集型的。簡單的錯配試驗，如高分辨率熔解分析（HRMA）和DNA裂解（通過T7核酸內切酶），在某些生物（如斑馬魚）中具有很差的特異性，基因組中具有高頻的多態性，可造成假陽性的結果。

同樣，限制性片段長度多態性分析受到靶位點選擇的限制。Yu等人開發的基于定量PCR反應的程序，是檢測體細胞活性的一種可行方法。然而，我們可能很難設計與預測切割位點重疊的穩定引物。最近兩種以序列為基礎的方法——稱為TIDE和CRISPR-GA，被用于細胞培養實驗中sgRNA活性的定量評價。然而，這兩種方法都有其應用的局限性。目前還沒有任何一種檢測，可以很容易地用于所有模型系統。

在這項研究中，研究人員證明了CRISPR-STAT在斑馬魚中用作預篩選方法來評估sgRNA特異性的效用。通過將CRISPR-STAT評估與產生sgRNA的的無克隆方法相結合，任何實驗室應該都可以在感興趣的基因中產生突變，并在飼養動物之前確證打靶的有效性。研究人員建議，每個基因應該設計至少兩個sgRNA，并評估一小部分的注射胚胎。這種方法有利于成功的誘變，并最大限度地減少了動物飼養和首建動物篩選的時間和成本。

作為原理驗證，研究人員在斑馬魚中檢測了這種方法，他們用具有已知和不同種系傳遞效率的28個sgRNA，分析了它們在注射胚胎中的體細胞活性。這些數據顯示，在注射胚胎的熒光PCR分析結果和種系傳遞效率之間，存在著強烈的正相關性。此外，這種方法非常敏感，足以評估多個基因打靶。雖然，該研究是利用CRISPR/Cas9和斑馬魚測試了這種方法，但是它也可以應用于其他動物模型系統，以及其他基因組靶向核酸酶。