彌補ChIP-seq缺陷的新工具

日期：2015-08-07 09:24:13

最近，研究人員開發出一種新技術，可精確地標記“稱為轉錄因子的調控蛋白，是在活細胞的細胞核中哪個部位與DNA相互作用”。

美國辛辛那提兒童醫院醫學中心的科學家，將這項研究結果發表在八月六日的《分子細胞》雜志（Molecular Cell）。這項新技術被稱為SpDamID，可讓科學家回答現有技術無法解決的、有關“組織發育和疾病”的基本問題。

本文資深作者、辛辛那提兒童醫院發育生物學主任Raphael Kopan博士指出：“這項技術的進一步發展，將使研究人員深入探討用現有工具無法回答的生物學問題。這種方法可能會改變我們的研究。”

細胞過程主要是由多種轉錄因子的共同作用而調節的，轉錄因子是結合染色體上特定DNA位點的蛋白質，可指引細胞應該做什么。疾病的過程通常開始于轉錄因子中的突變，或它們結合的DNA。這些遺傳變異可能導致細胞生長失控，逃避免疫系統，或不能執行保持健康所必需的基本功能。

要了解有缺陷的疾病過程，研究人員需要追蹤轉錄因子在何處以及如何與DNA相互作用，以確定健康細胞和患病細胞之間的差異?？紤]到人類基因組的大小，目前用于跟蹤蛋白質基因相互作用的研究方法，可能是繁瑣的、耗時的，而且不總是確定性的。

今天常用的一種流行方法，被稱為染色質免疫沉淀，結合新一代基因測序（ChIP-seq）。ChIP-seq的缺陷在于，它不能提供單個細胞中轉錄因子結合的確切細節，因為它采集的樣本事件發生在細胞暴露于各種有毒化學物質之后。關于一條DNA單鏈被不同轉錄因子占用的任何結論，都是基于推論。延伸閱讀：掌握技巧，做好ChIP-Seq并不難[創新技巧]。

研究人員報道稱，Kopan及其同事Matthew Hass博士開發的SpDamID技術，對于這些分析來說，是一種精確、快速和有效的方法。SpDamID是唯一能夠識別與多個蛋白相互作用的DNA的方法，這通常是基因調控中的關鍵一步。

作者報道稱，SpDamID可標記活細胞中的DNA，并且僅在兩個標記的蛋白在相同的DNA鏈上彼此接近相互作用的情況下。該技術是基于先前的一種稱為DamID的方法。Dam是一種酶（稱為DNA腺嘌呤甲基化酶）的首字母縮寫。

Hass和Kopan開發的方法，涉及到將Dam分裂為二，將一個功能性蛋白對半分為兩個不活躍的部分。研究人員將這些不活躍的DAM部分與他們認為彼此靠近結合的蛋白連接起來，或者說，為了結合DNA，它們彼此之間是相互作用的。這使得Dam酶再次變得活躍起來，并標記染色體上兩個蛋白相互作用的任何位置。

因為只有當兩個蛋白是在同一個細胞中，并在同一段DNA上時，才會發生這個反應，因此，這無疑能夠確定一對蛋白質的同步結合。此外，與ChIP-seq相比，該方法需要較少的細胞，從而可讓研究過程持續的時間有限，或者發生在小的細胞群中。

在目前的研究中，為了證明SpDamID的能力，作者在小鼠腎祖細胞（Mk4細胞）中分析了Notch介導的的轉錄激活。自1990年以來，Notch——參與和大部分組織器官發育和維持的關鍵分子，一直都是Kopan實驗室的焦點。這種分子的缺陷，在多種疾病中發揮核心作用，包括遺傳性腎臟疾?。ǚQ為Alagille綜合征）、腫瘤、CADASIL和多發性硬化癥。

Hass稱，他們開發出SpDamID，用以回答一些關于“Mk4細胞核中Notch轉錄調控”的重要問題。Notch是一種不直接與DNA結合的蛋白質。當Notch被打開時，它只在與一個DNA結合伴侶結合之后，才能結合DNA。反過來，Notch和它的合作伙伴可招募許多其他蛋白質，在幾個關鍵位置打開轉錄。”

作者報告說，當DAM不活躍的那一半附著于Notch及其重新結合的伙伴時，它們會重新激活并標記腎細胞中的結合DNA。這讓研究人員能夠確定存在Notch的所有關鍵位置。此外，這些位點靠近另一個轉錄因子Runx1著陸的位點。作者用SpDamID表明，Notch和RUNX1在同一細胞內被結合到同一染色體上，用ChIP-seq他們不可能收集到這一證據。