新型單細(xì)胞外顯子組測(cè)序法
日期：2015-03-31 09:01:46
最近，美國(guó)MD安德森癌癥研究中心和德克薩斯大學(xué)休斯敦健康科學(xué)中心的研究人員，開(kāi)發(fā)出一種新型單細(xì)胞外顯子組測(cè)序方法稱為SNES。與目前大多數(shù)單細(xì)胞測(cè)序方法形成對(duì)比，SNES利用細(xì)胞核而不是細(xì)胞進(jìn)行分析，從而將會(huì)在生物學(xué)許多不同領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2015年3月25日的國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊《Genome Biology》。延伸閱讀：Nature子刊發(fā)表單細(xì)胞基因組學(xué)重要進(jìn)展。
單細(xì)胞測(cè)序方法可讓我們深入闡述罕見(jiàn)細(xì)胞亞群和復(fù)雜細(xì)胞混合物的基因組，但目前存在的廣泛技術(shù)錯(cuò)誤和不良物理覆蓋數(shù)據(jù)帶來(lái)了一定的挑戰(zhàn)。雖然單細(xì)胞RNA測(cè)序方法的開(kāi)發(fā)已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但全基因組DNA測(cè)序方法的開(kāi)發(fā)，已被證明更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)閱渭?xì)胞含有每個(gè)mRNA分子的數(shù)千份拷貝，但只有每個(gè)染色體的兩個(gè)拷貝。因此，每個(gè)細(xì)胞只能提供兩個(gè)模板DNA用于全基因組擴(kuò)增反應(yīng)（WGA），所有后續(xù)的分子會(huì)繼承第一輪擴(kuò)增中發(fā)生的錯(cuò)誤。
在這項(xiàng)研究中，該研究小組開(kāi)發(fā)了一種新型單細(xì)胞外顯子組測(cè)序方法，稱為SNES，這種方法可以實(shí)現(xiàn)來(lái)自單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的外顯子組數(shù)據(jù)的高覆蓋率（96%）。從這些數(shù)據(jù)我們發(fā)現(xiàn)，我們可在堿基對(duì)的分辨率上，準(zhǔn)確地檢測(cè)SNVs和缺失。
在覆蓋范圍改進(jìn)方面的技術(shù)性能是由于多種因素，包括一種改進(jìn)的Phi29聚合酶（New England Biolabs公司）、時(shí)間有限的等溫?cái)U(kuò)增和使用22染色體qPCR板以在外顯子組捕獲和測(cè)序之前消除具有不良WGA性能的細(xì)胞。
與該研究小組以前的方法相反，SNES消除了文庫(kù)構(gòu)建對(duì)于Tn5轉(zhuǎn)座酶的需要，這可能會(huì)向人類(lèi)基因組中引入整合偏見(jiàn)，并導(dǎo)致覆蓋不均勻。通過(guò)用一種改進(jìn)的phi29聚合酶（New England Biolabs公司）進(jìn)行限時(shí)的等溫MDA，研究人員能夠減輕FP和FN的錯(cuò)誤率，從而提高SNVs和缺失的檢測(cè)效率。重要的是，SNES程序可消除用于細(xì)胞分離、WGA和文庫(kù)構(gòu)建的商品化試劑盒，從而將產(chǎn)生單細(xì)胞庫(kù)的成本減至大約為30美元每細(xì)胞（不包括外顯子捕獲試劑和測(cè)序成本）。這將讓研究人員能夠分析和復(fù)用大量細(xì)胞，這是大多數(shù)單細(xì)胞測(cè)序研究的目標(biāo)。
在這項(xiàng)研究中，研究人員直接比較了來(lái)自G1/0和G2/M期單細(xì)胞的數(shù)據(jù)，表明這兩類(lèi)細(xì)胞的覆蓋均勻性和廣度表現(xiàn)良好。然而，這些數(shù)據(jù)表明，使用G2/M期細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致等位基因丟失率更進(jìn)一步的的技術(shù)改進(jìn)。在未來(lái)，可以通過(guò)SNES與微流控平臺(tái)相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)（例如，Fluidigm）技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)，當(dāng)納升體積用于MDA反應(yīng)時(shí)這可以減少誤差。
與目前大多數(shù)單細(xì)胞測(cè)序方法形成對(duì)比，SNES利用細(xì)胞核而不是細(xì)胞進(jìn)行分析。比起使用細(xì)胞來(lái)說(shuō)，使用細(xì)胞核有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）細(xì)胞核可以用DAPI染色并且是封閉的，可避免收集已經(jīng)分解、凋亡或復(fù)制的細(xì)胞；2）細(xì)胞核可更準(zhǔn)確地存放以避免測(cè)定多個(gè)細(xì)胞；（3）細(xì)胞核可以從已存儲(chǔ)幾十年的冷凍組織樣本中分離。最后一點(diǎn)是儲(chǔ)存組織單細(xì)胞測(cè)序的關(guān)鍵，因?yàn)槔鋬隹蓴嗔讯鄶?shù)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜，但唯有核膜是完整，細(xì)胞核懸浮液可以容易地制備。然而，細(xì)胞核也有幾個(gè)明顯的局限性，包括可能丟失來(lái)自微核的DNA，細(xì)胞表面標(biāo)記物不能用來(lái)隔離特定的種群（例如，通過(guò)流分類(lèi)種進(jìn)行澆注）。因此，選擇使用細(xì)胞核還是細(xì)胞，將在很大程度上取決于研究項(xiàng)目的具體要求。
最后，研究人員預(yù)計(jì)，SNES將會(huì)在生物學(xué)許多不同領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，包括癌癥研究、微生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育和產(chǎn)前基因診斷，并會(huì)顯著提高我們對(duì)于人類(lèi)疾病的基本認(rèn)識(shí)。
