精確檢測(cè)CRISPR脫靶效應(yīng)的新方法

日期：2015-01-23 08:43:57

CRISPR和TALENs作為新興的基因組編輯技術(shù)，雖然優(yōu)勢(shì)多多，但是仍然被脫靶效應(yīng)所困擾。美國(guó)希望之城貝克曼研究所和浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院的研究人員開(kāi)發(fā)出一種新策略，有望幫助人們檢測(cè)這種意想不到的結(jié)果。這項(xiàng)成果于本周在線(xiàn)發(fā)表于《Nature Biotechnology》雜志上。

CRISPR和TALENs技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于研究中，而將來(lái)更有望用于臨床，但脫靶效應(yīng)的存在始終是個(gè)問(wèn)題。因此，需要有效的方法來(lái)確認(rèn)DNA切割是否在適當(dāng)?shù)奈恢谩Ｓ?jì)算機(jī)算法和體外選擇都能夠用來(lái)篩查潛在的脫靶位點(diǎn)，但它們往往不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。

為了開(kāi)發(fā)出一種更好的方法來(lái)檢測(cè)這兩種技術(shù)的脫靶效應(yīng)，希望之城的研究人員Jiing-Kuan Yee及其同事使用了一種基于整合酶缺陷型慢病毒載體（IDLV）的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)最初由德國(guó)癌癥研究中心的團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)，來(lái)鑒定鋅指核酸酶（ZFN）的意外切割。

在非同源末端連接（NHEJ）的DNA修復(fù)過(guò)程中，線(xiàn)性的雙鏈IDLV基因組能夠優(yōu)先整合到雙鏈斷裂（DSB）中。根據(jù)之前發(fā)表的文章，這些IDLV能夠引入ZFN處理的細(xì)胞，標(biāo)記DSB的位置。之后，利用線(xiàn)性擴(kuò)增介導(dǎo)的PCR，可定位IDLV的整合位點(diǎn)，揭示IFN是否擊中目標(biāo)位點(diǎn)。

受到這種方法的啟發(fā)，Jiing-Kuan Yee將其修改后應(yīng)用于CRISPR和TALENs。“本質(zhì)上是同一種方法，但我們利用一種不同的方法來(lái)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，”Yee談道。

在他們的實(shí)驗(yàn)中，Yee及其同事產(chǎn)生了靶定兩個(gè)基因的CRISPR/Cas9核酸酶和TALENs。這兩個(gè)基因分別是Wiskott-Aldrich綜合征（WAS）基因和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（TAT）基因。它們突變時(shí)會(huì)引起疾病。

研究人員利用表達(dá)CRISPR/Cas9核酸酶或TALENs的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK細(xì)胞，之后轉(zhuǎn)導(dǎo)了IDLV。這個(gè)IDLV攜帶的基因賦予了抗生素和嘌呤霉素的抗性。核酸酶形成DSB后，允許IDLV整合，使得耐受嘌呤霉素的克隆數(shù)量增加了兩到三倍。

對(duì)于CRISPR/Cas9和TALEN處理過(guò)的細(xì)胞，研究人員在目標(biāo)切割位點(diǎn)的60 bp內(nèi)鑒定出成簇的IDLV整合位點(diǎn)（CLIS）。當(dāng)他們尋找WAS和TAT基因以外的CLIS時(shí)，在TALEN處理的細(xì)胞中未找到脫靶位點(diǎn)，而在CRISPR/Cas9核酸酶中發(fā)現(xiàn)一些。之后他們利用芯片預(yù)測(cè)和深度測(cè)序來(lái)確定IDLV分析的靈敏度，發(fā)現(xiàn)它能夠檢測(cè)頻率低至1%的脫靶切割。